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Das humane Cytomegalovirus (HCMV) kann bei immunsupprimierten Patienten zu lebensbedrohlichen Organmanifestationen führen und ist weltweit die wichtigste kongenitale Virusinfektion. Die am häufigsten gegen HCMV eingesetzten Medikamente sind Ganciclovir, Cidofovir und Foscarnet. Durch eine frühe antivirale Therapie kann die Wahrscheinlichkeit einer klinisch manifesten Erkrankung reduziert werden, jedoch steigt mit der Therapiedauer auch die Wahrscheinlichkeit einer Virostatikaresistenzentwicklung. Die molekulare Ursache der Resistenzen gegen Ganciclovir sind Mutationen in der UL97- Serin-Threonin- Phosphotransferase, Mutationen in dem viralen Polymerasegen UL54 können zu Resistenzen gegen Ganciclovir, Cidofovir und Foscarnet führen. Heutzutage ist die Resistenztestung der Wahl die genotypische Empfindlichkeitstestung, da diese innerhalb von Stunden durchgeführt werden kann. Diese Methode erfordert allerdings, dass die Mutationen zuvor durch eine phänotypische Resistenztestung charakterisiert wurden, da nur so zwischen resistenzauslösenden Mutationen und einfachen Polymorphismen unterschieden werden kann.
In dieser Arbeit wurden mittels der „en-passant“ BAC-Technologie (Tischer et al., 2006) die von Houldcroft et al. neu entdeckten Mutationen UL97 S512Stop, UL97 C480F, UL97 I429F und UL54 P522Q, Kombinationen aus Mutationen in beiden Genen, nämlich UL54 P522Q / UL97 C480F, sowie die von Sedlak et al. neu gefundene Kombination aus zwei schon zuvor einzeln charakterisierten Mutationen UL54 V715 / UL97 L595S generiert und anschließend funktionell charakterisiert (Houldcroft et al., 2016, Hall Sedlak et al., 2013).
Eine Transfektion der verschiedenen Mutationen auf die Zellkultur war bei allen Mutationen erfolgreich, außer bei der UL97 Mutation S512Stop. Diese Mutation konnte auch bei dem ursprünglichen Patienten nur ein einziges Mal nachgewiesen werden (Houldcroft et al., 2016), sodass es wahrscheinlich ist, dass die Mutation UL97 S512Stop die Replikation von HCMV so stark einschränkt, dass ein weiteres Wachstum verhindert wird.
Da das Wachstumsverhalten einen großen Einfluss auf die Behandlung von HCMV haben kann, wurden die Einzel- und Doppelmutationen mit Hilfe von Ein-Schritt-Wachstumszyklen untersucht. Hierbei zeigte sich eine mögliche Wachstumshemmung der UL97-Mutation I429F.
Ob die einzelnen Mutationen und Doppelmutationen, die in dieser Arbeit charakterisiert werden sollten, resistenzauslösend sind, wurde über Plaquereduktionsassays bestimmt. Hierbei zeigten sich die Einzelmutationen UL54 P522Q und UL97 C480F jeweils sensibel gegenüber von Ganciclovir, Cidofovir und Foscarnet. Die Doppelmutation UL54 P522Q / UL97 C480F zeigte jedoch eine Ganciclovir- und möglicherweise auch eine Foscarnetresistenz. Dieses Phänomen sollte in weiteren Arbeiten genauer untersucht werden. Die UL97 Mutation I429F bewirkte eine Ganciclovirresistenz. Die Einzelmutation UL54 V715M wurde schon von Cihlar et al. als foscarnetresistent beschrieben (Cihlar et al., 1998). Bei UL97 L595S handelt es sich um eine der häufigsten Mutationen, die eine Ganciclovirresistenz verursachen (Wolf et al., 1995). In der Kombination wurden die beiden Mutationen in dieser Arbeit beschrieben und wie zu erwarten, zeigte auch die Doppelmutation eine Ganciclovir- und eine Foscarnetresistenz. |
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