Stellenwert der RT-PCR zur quantitativen Genexpressionsanalyse epigenetischer Modifikationen in HepG2 Zellen

Abstract

Medikamentenassoziierte Hepatotoxizität ist der häufigste Grund, warum zugelassene Medikamente wieder vom Markt genommen werden. Individuelle Unterschiede des menschlichen Metabolismus sind schwer abzuschätzen, sodass neue Medikamente vor einer klinischen Anwendung umfangreich auf Toxizität getestet werden müssen. In der präklinischen Medikamentenentwicklung werden dabei in vitro und Tierexperimente durchgeführt, wobei letztere nur bedingt auf den Menschen übertragbar sind. Der heutige Goldstandard für in vitro Tests auf medikamenteninduzierte Hepatotoxizität sind primäre humane Hepatozyten (PHHs). Diese haben allerdings nur eine begrenzte Verfügbarkeit, dedifferenzieren rasch in Kultur und haben eine variable Zellviabilität. Eine Alternative zu PHHs sind Hepatomzelllinien wie HepG2 Zellen. Diese zeichnen sich durch eine ständige Verfügbarkeit, einfache Handhabe und gute Standardisierung aus, haben aber im Vergleich zu PHHs trotz verschiedener Ansätze zur Optimierung eine deutlich niedrigere metabolische Kapazität. Die epigenetische Modifikation mittels 5-AZA und Vitamin C bewirkt in HepG2 Zellen zwar eine metabolische Verbesserung, jedoch wird dadurch keine ausreichende Annäherung an PHHs erreicht. Da die erzielte Wirkung dadurch relativ klein ist, ist es wichtig diese geringen Effekte durch empfindliche Nachweismethoden zuverlässig messen zu können. Auf Ebene der Genexpression weist die Methode der PCR eine hohe Spezifität, Sensitivität sowie einfache Durchführbarkeit auf, weswegen sie in der vorliegenden Arbeit auf Anwendbarkeit überprüft wurde. Dabei wurde die konventionelle RT-PCR mittels Gelelektrophorese der vollquantitativen qPCR gegenübergestellt und die Ergebnisse auf Plausibilität geprüft. Insbesondere vor dem Hintergrund der nur partiellen Quantität der konventionellen Methode sollte die Frage beantwortet werden, welchen Stellenwert die RT-PCR zur Messung kleiner Expressionsunterschiede haben kann. Betrachtet wurden dabei die Gene besonders relevanter Cytochrom P450 Oxidasen (CYPs) sowie epigenetisch relevante Gene, die einen nachgewiesenen Einfluss in der metabolischen Funktion von Hepatozyten haben. Es zeigten sich bei der Untersuchung variable Ergebnisse. Im Falle epigenetisch wirksamer Gene konnten beiden Methoden fast durchweg ähnliche Tendenzen im Sinne einer Annäherung an PHHs nachweisen. Die Expressionsanalyse untersuchter CYPs zeigte hingegen deutliche Grenzen der RT PCR auf. Hier war aufgrund niedriger Basalexpression in HepG2 Zellen eine Messung nur im hohen Zyklusbereich möglich. Insbesondere kleine Behandlungseffekte durch 5-AZA und Vitamin C konnten nur schwer nachgewiesen und die metabolische Kapazität von PHHs auf Gen Ebene schwer erfasst werden. Die qPCR lieferte in vielen Bereichen genauere Ergebnisse und zeigte sich zum Nachweis kleinerer Unterschiede deutlich sensitiver. Schlussendlich ist auszuführen, dass die konventionelle PCR in dieser Fragestellung eine zuverlässige und einfache Methode sein kann, um Genexpressionen zu messen. In Zelllinien wie HepG2, die eine niedrige Basalexpression bestimmter Gene zeigen, können insbesondere kleine Expressionsunterschiede mitunter nur schwer detektiert werden. Auch die vollumfängliche Erfassung stark abweichender Expressionslevel metabolisch relevanter Gene kann sich im direkten Vergleich mit PHHs schwierig gestalten und macht die Anwendung einer vollquantitativen PCR erforderlich. Die weitere Optimierung durch Additive und alternative Fluoreszenzfarbstoffe zur Sensitivitätssteigerung bleibt Gegenstand aktueller Forschung und könnte die konventionelle Methode zukünftig noch nützlicher im Rahmen der Erforschung metabolischer Optimierungen neuer in vitro Verfahren machen.