Untersuchung zur PXR-abhängigen Regulation von ETNPPL und SEC14L4 in menschlichen Leberzellen und des Einflusses von ETNPPL auf die Phospholipidsynthese

Abstract

Der Pregnan X Rezeptor (PXR) beeinflusst als Liganden-abhängiger Kernrezeptor hauptsächlich die Verstoffwechslung und Eliminierung von Fremdstoffen durch Regulation der Gene, die für arzneimittelabbauende Enzyme und Medikamententransporter kodieren. Außerdem ist bekannt, dass PXR auch an der Regulation des Glukosemetabolismus beteiligt ist und durch Induktion der de novo Lipogenese Einfluss auf den Lipidmetabolismus hat. Während die Regulation des Fremdstoff-, Glukose- und Lipidmetabolismus durch PXR bereits ausführlich untersucht wurde, gibt es, wie Genom-weite Genexpressionsanalysen nahelegen, noch weitere Synthese- und Signalwege, die durch PXR reguliert werden könnten. Diese Arbeit fokussiert sich auf die Gene ETNPPL und SEC14L4, deren Expression in primären humanen Hepatozyten durch Behandlung mit PXR Liganden induziert wird. Während für ETNPPL bekannt ist, dass es die irreversible und höchst spezifische Reaktion von Phosphoethanolamin zu Acetaldehyd, Ammoniak und Phosphat katalysiert, ist für das SEC14L4 die genaue Funktion noch nicht bekannt. Da das Phosphoethanolamin der Vorläufer für das Phosphatidylethanolamin ist, eines der vier hauptsächlichen Membranlipide, kann vermutet werden, dass eine PXR-abhängige Regulation der ETNPPL Expression Einfluss auf die Lipidsynthese durch den CDP-Ethanolamin Syntheseweg hat. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Regulierung von ETNPPL und SEC14L4 durch PXR aufzuklären. Weiterhin galt es die funktionelle Bedeutung dieser Regulation für die Synthese von Phosphatidylethanolamin zu untersuchen. Durch Kombination von siRNA-vermitteltem Knockdown und quantitativer Echtzeit PCR konnte gezeigt werden, dass beide Gene PXR-abhängig reguliert werden. Die Regulation der ETNPPL mRNA durch PXR erscheint funktionell relevant zu sein, da auch die Proteinexpression durch PXR-Aktivierung induziert wird. Zur Aufklärung der molekularen Mechanismen wurde eine in silico Analyse der beiden Gene auf das Vorhandensein potenzieller PXR-Bindestellen durchgeführt. Im ETNPPL-Gen wurden zwei Regionen mit potenziellen PXR-Bindestellen als PXR-abhängige Enhancer identifiziert (R1- und R2-Region). Die in vitro Bindung von PXR an die entsprechenden Motive der Enhancerregionen konnte mittels EMSA bestätigt und die in vivo Bindung der R1-Region mittels Chromatin Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Durch die Mutationsanalyse der Bindestellen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung durch PXR in jedem Enhancer von mehreren Bindemotiven abhängt. Für das SEC14L4-Gen konnten mindestens zwei Regionen als potenziell PXR-abhängige Enhancer identifiziert werden (SE5- und S4-Region). Für die SE5-Enhancerregion wurde mittels EMSA die in vitro Bindung von PXR an die entsprechenden Motive bestätigt. Auch die Regulierung durch den Leber X Rezeptor (LXR), ebenfalls ein Kernrezeptor, der in der Leber exprimiert wird und hauptsächlich den hepatischen Triglyzerid- und Cholesterolmetabolismus reguliert, wurde für die Gene des CDP-Ethanolamin Synthesewegs, sowie für ETNPPL und SEC14L4 untersucht. Eine Regulierung durch PXR und LXR oder PXR-spezifisch, konnte nur für ETNPPL, SEC14L4 und die Ethanolaminkinase 2 (ETNK2) nachgewiesen werden. Die Bedeutung der PXR-Aktivierung für den Phosphoethanolaminspiegel und die Synthese von Phosphatidylethanolamin wurde mittels LC-ESI-MS/MS untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Phosphoethanolaminkonzentration in primären humanen Hepatozyten nach PXR-Aktivierung deutlich reduziert war. Weiterhin konnte in einem Pilotversuch mit Isotopen-markiertem Ethanolamin eine Reduktion der neusynthetisierten Phosphatidylethanolaminspezies nach PXR-Aktivierung festgestellt werden. Durch Induktion von ETNPPL und eventuell auch Hemmung der ETNK2 Expression in der Leber scheint PXR die Neusynthese von PE negativ zu beeinflussen. Dadurch kann es zu einem veränderten Phosphatidylcholin/-ethanolamin -Verhältnis in der Zellmembran kommen, was zu einem Verlust der Membranintegrität und erhöhter Membranpermeabilität führen könnte oder es hat einen protektiven Effekt, in dem die erhöhte ETNPPL Expression die Zelle vor zu hohen Phosphoethanolaminkonzentrationen schützt.