Die Rolle von Chorein in der Regulierung des speicherabhängigen Ca2+-Einstroms in Tumorzellen

Abstract

Chorein ist ein Protein, das durch das Gen VPS13A (Vesikel-assoziiertes Membranprotein 8) kodiert wird. Ein Defekt in diesem Gen führt zur Chorea-Akanthozytose, einer Erkrankung, die durch eine progrediente Neurodegeneration sowie Akanthozytose gekennzeichnet ist. Chorein ist an Vorgängen der Exozytose und des intrazellulären Lipidtransportes beteiligt und stabilisiert das Zytoskelett. Zudem kann Chorein durch die Aktivierung der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) das Überleben von Tumorzellen fördern. Das Überleben sowie weitere Tumor-definierende Eigenschaften wie die Proliferation, Migration und Invasion werden wesentlich durch intrazelluläre Ca2+-Signalvorgänge beeinflusst. Leeren sich die intrazellulären Ca2+-Speicher, werden sie durch den Speicherabhängigen Kalziumeinstrom (SOCE) wiederbefüllt. Die Hauptaktuere des SOCE, das Ca2+-Sensorprotein Stromales Interaktionsmolekül 1 (STIM1) und das Ca2+-Kanalprotein Orai1, werden in ihrer Transkription durch die Serum- und Glukokortikoid-regulierte Kinase 1 (SGK1) und den Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NFκB) reguliert. SGK1 wiederum ist ein Zielprotein des PI3K-Weges. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob Chorein SOCE und seine Komponenten beeinflusst und dieser Effekt auf die Veränderung der SGK1 zurückzuführen ist. Die alveoläre Rhabdomyosarkomzellinie ZF weist eine hohe Expression und Abhängigkeit von Chorein auf und diente als Modell für die Untersuchungen.

Um die Wirkung von Chorein zu untersuchen, wurde die Chorein-Expression in ZF-Zellen mittels Knockdown des Gens VPS13A vermindert. SOCE wurde durch die Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit dem Farbstoff Fura-2 nach Leerung der intrazellulären Ca2+-Speicher mittels Thapsigargin fluoreszenzmikroskopisch erfasst. Die Transkription von Chorein, SGK1, NFκB, STIM1, STIM2 und Orai1 wurden mit Hilfe der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion nach reverser Transkription (RT-PCR) quantifiziert. Die Orai1 Proteinmenge wurde mittels Western Blot, Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie dargestellt.

Nach dem Gen-Knockdown von VPS13A konnte ein geringerer SOCE beobachtet werden. Diese basierte auf einer Verminderung der Orai1-Expression mit Reduktion der Orai1-Proteinmenge in der gesamten Zelle sowie auf der Zelloberfläche. Zusätzlich zeigte sich eine verminderte Expression von STIM2, nicht aber von STIM1. Der Gen-Knockdown von VPS13A führte zu einem Rückgang der SGK1- und NFκB1-Transkription. Versuche mit dem Orai1-Inhibitor 2-Aminoethoxydiphenylborat, SGK1-Inhibitor EMD638683 und NFκB-Inhibitor Wogonin resultierten ebenfalls in einer Verminderung des SOCE.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Chorein SOCE in ZF-Rhabdomyosarkomzellen beeinflusst. Dies erfolgt durch die Steuerung der Orai1- und STIM2-Expression, ein Effekt, der mindestens zum Teil auf die Aktivierung von SGK1 und NFκB zurückzuführen ist. Die Ergebnisse bekräftigen die Rolle von Chorein in Tumorzellen und ihr therapeutisches Potenzial in der Krebstherapie.