Inhaltszusammenfassung:
Licht ist für den pflanzlichen Lebenszyklus von größter Bedeutung als Energiequelle und essentieller Taktgeber für die Entwicklung der Pflanze. Nach der Keimung weisen im Dunkeln gewachsene Keimlinge geschlossene, fahle Keimblätter, einen apikalen Haken, lange Hypokotyle und kurze Wurzeln auf. Lichtexposition leitet die Photomorphogenese ein, wodurch die Keimlinge ihre Keimblätter öffnen, Photosynthese betreibende Chloroplasten ausbilden, das Hypokotyllängenwachstum verringern und ihr Wurzelsystem expandieren. Dieser Entwicklungsprozess wird von einer lichtinduzierten, transkriptomweiten Umprogrammierung inklusive substantieller Veränderung des alternativen Spleißens (AS) für mehrere hundert Gene begleitet. Die Mehrheit aller dunkelexprimierten Spleißvarianten weist erstaunlicherweise Sequenzmerkmale auf, welche Nonsens-vermittelter mRNA Abbau (engl.: nonsense-mediated mRNA decay, NMD) auslösen, wohingegen Lichtexposition zur Bildung der wahrscheinlich proteinkodierenden Spleißvariante führt. Für den Spleißregulator REDUCED RED LIGHT RESPONSE IN CRY1 CRY2 BACKGROUND (RRC1) konnten wir zeigen, dass eine lichtinitiierte Spleißmusterverschiebung zur funktionellen mRNA-Variante einen signifikanten Effekt auf das Hypokotyllängenwachstum hat. Allerdings, gibt es auch Transkripte mit NMD-Merkmalen, die dem gezielten RNA-Abbau durch NMD entgehen. Die im Dunkeln favorisierte Spleißvariante von SERINE-ARGININE-RICH PROTEIN 30 (SR30), SR30.2, scheint NMD-immun zu sein, trotz eindeutiger NMD-Merkmale. Wir konnten zeigen, dass SR30.2 im Zellkern zurückgehalten wird und in viel geringerem Ausmaß als SR30.1 mit Ribosomen assoziiert ist. Da Translation eine Voraussetzung für NMD ist, erscheint SR30.2 NMD-resistent. Lichtexposition verschiebt das Spleißmuster zu SR30.1 und fördert die SR30 Proteinexpression. Interessanterweise führt die Überexpression von SR30.2 zur Akkumulation der schwach exprimierten und NMD-sensitiven Spleißvariante SR30.3. Unter Verwendung der verbleibenden 3'-Spleißstelle in SR30.2, kann SR30.3 durch einen sequentiellen Spleißschritt gebildet werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen einen komplexen Regulationsmechanismus für die Genexpression von SR30 durch AS-vermittelte subzelluläre Kompartimentierung der Spleißvarianten. Im Gegensatz zu einzelnen gut charakterisierten AS-Ereignissen, ist nur wenig über die Regulation von lichtabhängigen Spleißmustern bekannt. Exogene Zugabe von verschiedenen Zuckern oder Inhibitoren, die die Photosynthese oder die Kinase-Signalübertragung hemmen, suggerierten, dass zentrale Enerigesensoren einen Einfluss auf lichtempfindliche Spleißmuster haben. Interessanterweise korrelierte die Geneexpression von DARK INDUCIBLE (DIN) 1 und 6, Zielgene des zentralen Energiesensors SNF1-RELATED KINASE1 (SnRK1), mit den lichtvermittelte AS-Ereignissen. Daher haben wir induzierbare amiR-SnRK1-Mutanten zur weiteren Untersuchung generiert. Die Unterdrückung der SnRK1 Signaltransduktion führte zu beschleunigter Seneszenz bei lichtgewachsenen Pflanzen, während etiolierte amiR-SnRK1-Keimlinge verkürzte Hypokotyle zeigten. Bemerkenswert ist, dass die Unterdrückung des SnRK1-Signalweges eine Verschiebung zur lichtabhängigen Spleißvariante für eine Teilmenge der analysierten AS-Ereignisse bewirkte. Einige AS-Ereignisse zeigten jedoch keine Reaktion auf die SnRK1-Inhibition und verweisen auf einen anderen Regulationsmechanismus. Die Analyse des SnRK1-Antagonisten TARGET OF RAPAMYCIN (TOR) ergab, dass eine Herunterregulierung der TOR Expression zu vergleichbaren Phänotypen und AS-Antworten wie für die SnRK1-Mutanten führte. Wir schließen aus unseren Erkenntnissen, dass AS durch den Energiestatus der Pflanze reguliert wird und damit zur lichtabhängige Genexpression während der Photomorphogenese beträgt.
Abstract:
Light is of utmost importance for the plant life cycle since it serves as energy source and trigger for plant development. Dark-grown seedlings exhibit closed and pale cotyledons, an apical hook, enlarged hypocotyls and short roots. The photomorphogenic growth is initiated upon first illumination, and the seedling opens up the cotyledons, chloroplasts differentiate to start photosynthesis, hypocotyl elongation is reduced and the root system extends. This developmental transition is characterized and driven by massive reprogramming of gene expression including light-induced changes of alternative splicing (AS) patterns for several hundred events. Remarkably, the majority of dark-expressed splice variants carry nonsense-mediated decay (NMD)-eliciting features. For many light-regulated AS events, illumination provokes the switch to likely productive variants as shown for REDUCED RED LIGHT RESPONSE IN CRY1 CRY2 BACKGROUND (RRC1) with profound effects on hypocotyl growth. However, the presence of NMD-triggering features does not necessarily result in accelerated RNA decay. The dark-promoted splice variant of SERINE-ARGININE-RICH PROTEIN 30 (SR30), SR30.2, appears to be NMD-insensitive although it has a long and intron-containing 3’ untranslated region. We could demonstrate that nuclear retention prevents SR30.2 from being translated, making it NMD immune. Light exposure initiates splicing to SR30.1 by using a downstream 3’ splice site. SR30.1 is exported to the cytosol and associates with ribosomes for being translated. Moreover, strong expression of SR30.2 resulted in the accumulation of the minor and NMD-sensitive splicing variant SR30.3. We provided evidence that SR30.3 originates from SR30.2 by a sequential splicing step using the remaining 3’ splice site in SR30.2. This example highlights complex and light-dependent regulation of SR30 expression via subcellular compartmentation of its splicing variants. However, little is known about the regulation upstream of light-regulated AS. Physiological experiments with photoreceptor mutants, exogenous application of different sugars and inhibitors targeting photosynthesis or kinase signaling suggested an important role of energy signaling in light-responsive AS. Interestingly, targets of the central energy sensor SNF1-RELATED KINASE1 (SnRK1) correlated in their expression with light-induced AS shifts. Therefore, we generated inducible amiR-SnRK1 lines for further investigation. Repression of SnRK1 resulted in light-grown plants in accelerated senescence, whereas etiolated amiR-SnRK1 seedlings displayed shortened hypocotyls. Remarkably, a subset of analyzed AS events were shifted to the light-driven splice variant upon amiR-SnRK1 induction in dark-grown seedlings. However, some AS events did not respond pointing to a different regulation. Surprisingly, inhibition of the SnRK1 antagonist TARGET OF RAPAMYCIN (TOR) resulted in comparable phenotypes and AS responses as seen upon SnRK1 repression. We conclude from our findings that energy signaling regulates light-dependent gene expression also via the mechanism of AS.
splice regulators