Three-Dimensional In Vitro Models To Assess Pancreatic β-Cell Function

Abstract

Für einen allgemein guten Gesundheitszustand ist der menschliche Körper auf eine zuverlässige Blutzuckerkontrolle durch die Langerhans’schen Inselzellen im Pankreas angewiesen. Erschöpfung und Dysfunktion von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse sind Kernelemente der Pathogenese des Diabetes Mellitus (DM). Die Lebenserwartung und -qualität von DM-Patienten wurde durch subkutane Insulininjektionen deutlich verbessert. Dieser lebenslange Therapieansatz ist allerdings mit erheblichen Risiken und Einschränkungen im Tagesablauf der Patienten verbunden. Die Transplantation von Inselzellen zur Stabilisierung des Blutzuckerspiegels, als Alternative zu subkutanen Insulininjektionen, hat sich bisher nicht durchsetzen können. Daher lag der Fokus der DM-Forschung in den letzten Jahrzehnten auf der Entwicklung von biotechnologischen Lösungen, die das Überleben sowie die Funktion von β-Zellen unterstützen sollen. Ein Großteil aktueller Studien basiert jedoch ausschließlich auf Tiermodellen, was die klinische Umsetzbarkeit der Ergebnisse aufgrund verschiedener artspezifischer Unterschiede erschwert. Den derzeitigen in vitro Modellen mangelt es sowohl an physiologischer Relevanz als auch an der Zuverlässigkeit, das Verhalten im klinischen Setup vorherzusagen. Aufgrund dessen besteht für den Bereich der DM-Forschung ein dringender Bedarf an der Entwicklung von in vitro Modellen humangenetischen Ursprungs mit hoher physiologischer Relevanz. In dieser Arbeit wurden in vitro Modelle auf der Basis von β-Zell-Aggregaten, sogenannten Pseudo-Inseln, entwickelt, mit deren Hilfe man die Glukose-stimulierte Insulinsekretion der β-Zellen untersuchen kann. Es wurde ein Post-Transplantationsmodell etabliert, mit welchem zeitabhängig Hypoxie-induzierte Schäden identifiziert werden konnten. Mittels einem auf Mikrofluidik basierendem Pankreas-on-a-Chip-System wurde die Pseudo-Inseln mit Zellkulturmedium umspült, welches die Durchblutung im Pankreasgewebe simuliert. Weiterhin untersuchten wir die Einsatzmöglichkeit von Raman-Mikrospektroskopie sowie Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) zur Analyse von Pseudo-Insel-Funktionen. Spezifische Raman-Spektren und FLIM-Stoffwechselprofile von β-Zellen unter Glukosestimulation wurde nicht-invasiv und ohne Zuhilfenahme von Markern identifiziert. Darüber hinaus konnten metabolische Veränderungen in hypoxischen Pseudo-Inseln mittels FLIM früher identifiziert werden, als es mit herkömmlichen, Marker-basierten Methoden möglich war. Die in vitro Modelle, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, wurden außerdem verwendet, um den Einfluss der beiden extrazellulären Matrix- (EZM) Proteine Kollagen Typ 1 (COL1) und Nidogen-1 (NID1) sowie die Ko-Kultur von Pseudo-Inseln mit Endothelzellen (EZs) in einem in vitro Post-Transplantationsmodell zu untersuchen. In diesem Modell demonstrierten wir die positive Wirkung von COL1, NID1 und den EZs auf die Insulinsekretion, EZM-Expression und das Überleben der β-Zellen. Es ist hervorzuheben, dass im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal das therapeutische Potential von NID1 als β-Zell-unterstützendes Protein gezeigt wurde. Wir identifizierten das Integrin αvβ3 in der β-Zellmembran als Bindungspartner für NID1, welches nach Bindung mit NID1 den MAPK-Signalweg aktiviert. Insgesamt demonstriert diese Arbeit das große Potential physiologisch relevanter in vitro Modelle für die DM-Forschung.

To ensure a healthy state, the human body relies on a tight control of its blood glucose levels ensured by pancreatic islets. Depletion and dysfunction of pancreatic β-cells are key elements of the pathogenesis of Diabetes Mellitus (DM). The life expectancy of DM patients has been considerably expanded by insulin injections; a life-long treatment approach that comes with significant risks and strongly affects patient’s daily routine. Envisioned as a promising alternative, the transplantation of islets has largely failed to sustain long-term normoglycemia. Hence, the development of bioengineered solutions to support islet function and survival has been a growing focus of research in the last decades. A majority of studies, however, are entirely based on animal models, hampering clinical translation due to various species-specific differences. Current in vitro alternatives lack physiological relevance and have failed to predict clinical responses. Therefore, there is an urgent need to develop in vitro models with a human genetic origin and high physiological relevance for the DM field. In this thesis, in vitro models were developed using aggregates of pancreatic β-cells, so-called pseudo-islets, which responded to glucose stimuli by secreting insulin. A post-transplantation model was established where hypoxia-induced damage could be identified in a time-dependent manner. Using a pancreas-on-a-chip microfluidic device, vasculature-like flow was provided to the pseudo-islets. We explored the use of Raman microspectroscopy and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to monitor pseudo-islet function. Specific Raman spectra and FLIM metabolic profiles were identified for glucose-stimulation in a non-invasive label-free manner. In addition, FLIM could determine metabolic shifts in hypoxic pseudo-islets at an early on-set while traditional methods could not. The in vitro models developed in this thesis were used to evaluate the impact of extracellular matrix (ECM) proteins collagen type 1 (COL1) and nidogen-1 (NID1), as well as endothelial cells (ECs) in an in vitro post-transplantation model. We showed the beneficial effect of COL1, NID1 and ECs on insulin secretion, ECM expression and survival of β-cells. Importantly, for the first time, the therapeutic potential of NID1 as support for β-cells was demonstrated. The integrin αvβ3 was identified as primary NID1 binding partner which activated the MAPK pathway. Altogether, this work demonstrated the great potential of physiologically relevant in vitro models for DM research.