Identifikation olfaktorischer Entwicklungsstadien im hipSZ-basierten Differenzierungsprotokoll

Abstract

Der Geruchssinn findet trotz seiner psychologischen Relevanz und alltäglichen Funktion noch vergleichsweise wenig Beachtung. Dementsprechend beschäftigt sich auch die olfaktorische Forschung noch weitgehend mit grundlegenden Erkenntnissen und gewinnt nur langsam an Stellenwert, etwa in Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie beispielsweise Morbus Parkinson. Durch seine Fähigkeit zur Regeneration und der einzigartigen Konstellation einer direkten Verbindung primärer Sinnesneurone zur Außenwelt hat das olfaktorische System jedoch besonderes Interesse verdient. In dieser Arbeit wurden auf Basis humaner induziert pluripotenter Stammzellen Diffe- renzierungen durchgeführt und diese auf die Entstehung olfaktorischer embryonaler Ent- wicklungsstadien hin untersucht. Dabei wurde der Fokus auf die Stadien der präplakodalen Region, der olfaktorischen Plakode sowie der olfaktorischer Rezeptorneurone (ORN) gelegt. Hier wurden auf Grundlage neuronaler Differenzierungsprotokolle unter anderem FGF-, BMP-, WNT- und TGF-Beta-Signalwege beeinflusst. Zur Analyse wurden jeweils immunhistochemische Färbungen und qRT-PCR verwendet. Im ersten Schritt wurden zwei Protokolle mit Anpassungen hinsichtlich der Signalwegs- transduktion bezüglich ihrer Eignung zur Generierung präplakodaler Zellen sowie olfak- torischer Plakodenzellen verglichen. Auf präplakodaler Ebene konnte in jeweils gemischten Zellkulturen unter anderem durch die Detektion der spezifischen präplakodalen Marker SIX und EYA in beiden Differenzierungen die Generierung präplakodaler Zellen bestätigt werden. Jedoch zeigten sich in der Differenzierung mit Fokus auf dem TGF-Beta-Signalweg deutlich weniger positive Signale. Im zweiten Schritt erfolgte deshalb eine Langzeitdifferenzierung hinsichtlich olfaktorischer Rezeptorneurone mit Fokus auf dem FGF8-Signalweg. Es entstand eine neuronale Mischkultur, in welcher OMP-positive/TUBB3-negative Neurone detektiert werden konnten, die aufgrund ihrer immunhistochemischen Eigenschaften, ihrer RNA-Expressionen sowie ihrer bipolaren Morphologie als olfaktorische Rezeptorneurone eingeordnet wurden. Die hier durchgeführten Differenzierungen zeigen erste positive Ergebnisse auf dem Weg zur Generierung dieses komplizierten sensorischen Systems. Jedoch müssen die hier verwendeten Protokolle eindeutiger analysiert und hinsichtlich ihrer Effizienz verbessert werden.