Inhaltszusammenfassung:
Metabolomics ist die möglichst umfassende Analyse der Stoffwechsel-Intermediate (Metaboliten) eines biologischen Systems. In der klinisch-pharmakologischen Forschung wird dieser innovative Ansatz zunehmend genutzt, um Erkenntnisse über die Pathophysiologie komplexer Erkrankungen zu erlangen und mögliche Therapiewege zu finden.
Da sich die meisten Krebszellen durch charakteristische Stoffwechselveränderungen auszeichnen, stellt Metabolomics auch in der Erforschung von Tumorerkrankungen ein vielversprechendes Mittel zur Identifizierung potenzieller Biomarker und therapeutischer Targets dar. In diesem Zusammenhang gewinnt besonders der nicht zielgerichtete Ansatz „non-targeted Metabolomics“ an Bedeutung. Dieser zielt darauf ab, mit einer einzelnen Analyse den Stoffwechselzustand der untersuchten Matrix komplett zu erfassen und eignet sich daher besonders zur Generierung neuer Hypothesen. Hierfür wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Methoden zur Extraktion und Analyse des Metaboloms und Lipidoms aus (I.) Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe und (II.) Tumor-Organoiden des kolorektalen Karzinoms entwickelt. Die analytische Messung der Extrakte erfolgte mittels Flüssigchromatographie-Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie (LC-QTOF-MS) und die erarbeiteten Extraktionsmethoden wurden hinsichtlich der Signalintensität sowie der analytischen und methodischen Präzision und der Wiederholbarkeit optimiert und validiert. Des Weiteren (III.) erfolgte die vorläufige Evaluierung eines Mikrofluss-Chromatographie-Systems, betrieben mit Kapillarchromatographie Flussraten (< 10 µL/min) und Säulendimensionen (< 500 µm), hinsichtlich seiner Leistungsfähigkeit für non-targeted Metabolomics-Analysen. Hierfür wurde die analytische Präzision, die Anzahl detektierbarer Signale sowie das Signal-Rausch-Verhältnis und die Signalintensität von 16 annotierten Metaboliten in Extrakten von FFPE Schweinenierengewebe bewertet.
I. Die Herstellung von FFPE Gewebe zur Konservierung und anschließenden histopathologischen Untersuchung ist ein Standardprozess in der klinischen Diagnostik. FFPE Gewebeproben werden weltweit in Archiven gelagert und stellen eine wertvolle Ressource für retrospektive Studien dar. Die wenigen bislang etablierten Protokolle zur Analyse des Metaboloms von FFPE Gewebe sind vor allem auf das Erfassen polarer Metaboliten ausgerichtet, während Lipide nicht im Fokus stehen. In der vorliegenden Arbeit wurde über einen umfangreichen Methodenvergleich ein optimiertes Extraktionsprotokoll zur Analyse des Metaboloms und Lipidoms von FFPE Nierengewebe etabliert. Das Protokoll wurde auf der Basis von strukturell annotierten Metaboliten validiert und seine Anwendbarkeit durch die Unterscheidung von FFPE Proben des klarzelligen Nierenzellkarzinoms (ccRCC) von korrespondierendem Normalgewebe, auf Grundlage differenzieller Metaboliten-Profile, demonstriert. Des Weiteren wurde das Protokoll eingesetzt, um den Einfluss der Fixierzeit (Verweildauer des Gewebes in Formalin) auf die Metabolitenprofile in FFPE Gewebe zu untersuchen. Hierbei konnten Metaboliten identifiziert werden, deren Signale durch die Fixierzeit nicht beeinflusst wurden. Um deren Eignung für weiterführende Experimente zu prüfen, erfolgte die Detektion ausgewählter Metaboliten über bildgebende Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Fourier-Transform Ionenzyklotronresonanz Massenspektrometrie in einer unabhängigen ccRCC Kohorte.
II. Organoide sind innovative 3D Organmodelle, die in vitro aus Stammzellen generiert werden und die die Komplexität und Funktionalität eines Organs wesentlich präziser widerspiegeln als herkömmliche 2D Zellkulturen. Durch die Möglichkeit aus Tumorbiopsien Organoide zu kultivieren, deren genetisches Profil dem Ausgangsgewebe weitgehend entspricht, spielt diese Zellkulturtechnik mittlerweile eine zentrale Rolle in der personalisierten Medizin und im Medikamentenscreening. In der vorliegenden Arbeit wurden Extraktionsprotokolle zur Charakterisierung des Metaboloms von in extrazellulärer Matrix (ECM) kultivierten Organoiden des kolorektalen Karzinoms (CRC) mittels non-targeted LC-QTOF-MS evaluiert. Zur präzisen Normalisierung und statistischen Analyse wurde ein Filterprozess zum Entfernen von Hintergrundsignalen eingeführt, der auf statistischer Signifikanz (p-Wert, Welch’s Test) und fold change-Grenzwerten (biologisches Signal/ECM Blanksignal) beruht. Die optimierte Methode wurde durch die Analyse der dosisabhängigen metabolischen Antwort von CRC Organoiden auf die Behandlung mit 5-Fluorouracil (5-FU), über drei unabhängige Experimente hinweg, auf ihre Wiederholbarkeit validiert. In Übereinstimmung mit dem Wirkungsmechanismus von 5-FU wurden wiederholt signifikante metabolische Veränderungen detektiert (erhöhte Spiegel an 2'-Deoxyuridin, 2'-O-Methylcytidin, Inosin und 1-Methyladenosin sowie eine Verminderung von 2'-Deoxyadenosin und bestimmten Phospholipid-Spezies), was die Qualität der etablierten Methode demonstriert und den Weg zur Anwendung in größer angelegten Studien ebnet.
III. Non-targeted Metabolomics-Untersuchungen zur Findung diagnostischer oder prognostischer Biomarker basieren häufig auf Proben, die nur in limitierter Menge vorhanden sind (z.B. Biopsien oder Metastasen). Da die Empfindlichkeit der massenspektrometrischen Detektion durch eine Reduzierung des Säuleninnendurchmessers und durch den Einsatz niedriger Flussraten erheblich gesteigert werden kann, empfiehlt sich die Nutzung von Nano- und Mikrofluss-LC-Systemen zur Untersuchung seltener klinischer Proben. In der vorliegenden Arbeit wurde eine vorläufige Evaluierung des Zirconium™ Ultra Nano- und Micro-UHPLC Systems (Prolab), betrieben im Kapillarchromatographie Modus (CapLC, Flussrate: 5 µL/min, Säuleninnendurchmesser: 0,3 mm), in Kombination mit einem Zirconium™ CUBE Autosampler (Prolab) und einem speziellen Micro-ESI-Interface Prototypen (Prolab) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit einer im Haus etablierten Plattform für non-targeted Metabolomics-Analysen, welche auf analytischen Flussraten (400 µL/min) und Säulendimensionen (2.1 mm, sogenannte narrow bore LC) basiert, verglichen. Im Hinblick auf die Anzahl der detektierten Signale (Features) konnte hierbei kein nennenswerter Unterschied zwischen den Systemen beobachtet werden. Während bei den Signalflächen unter Verwendung der CapLC eine Verbesserung bei allen 16 Metaboliten festgestellt wurde, war das Signal-Rausch-Verhältnis für nur 50 % der Metaboliten verbessert. Darüber hinaus war die analytische Präzision unter Verwendung des CapLC-Systems (median CV = 11,8 %), verglichen mit dem narrow-bore LC-System (median CV = 2,9 %), geringer. Ein unabhängiges Experiment, durchgeführt mit Gallensäure-Referenzsubstanzen (ohne biologische Matrix), ergab jedoch eine bis zu 80-fache Erhöhung der Peakfläche (für Taurocholsäure) und eine zufriedenstellende Messpräzision. Die Ergebnisse des Plattformvergleichs deuten darauf hin, dass die beobachteten Effekte von der Art der analysierten Metaboliten abhängig sind. In diesem Kontext sind weitere Versuche nötig um zu überprüfen, ob die sehr guten Ergebnisse für Gallensäure-Reinsubstanzen in biologischer Matrix reproduziert werden können und ob die getestete CapLC-Plattform unter Umständen besser für spezielle targeted Metabolomics-Ansätze geeignet ist, als für non-targeted Metabolomics seltener klinischer Proben.
LC-QTOF-MS
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