Inhaltszusammenfassung:
Einleitung: Lysophosphatidylcholinen (LPCs) wird eine regulierende Funktion in der Entstehung von Entzündungen und Atherosklerose zugeschrieben und erhöhte intrazelluläre und/oder erniedrigte zirkulierende LPC-Konzentrationen im Blut wurden mehrfach im Rahmen von Fettleibigkeit und Insulinresistenz berichtet. Die Zielsetzung dieser Studie bestand in der Aufklärung der intrazellulären und extrazellulären LPC-Kinetik von primären humanen Myotuben (hMT) nach der Stimulation mit Palmitat als Korrelat für eine erhöhte metabolische Beanspruchung durch freie Fettsäuren sowie der Untersuchung auf mögliche Zusammenhänge mit In-vivo-Charakteristika der Donoren und/oder weiteren In-vitro-Ergebnissen.
Methoden: Muskelsatellitenzellen wurden von Muskelbiopsien des M. vastus lateralis bei 12 schlanken, metabolisch gesunden Teilnehmern der Tübinger Familienstudie (TUEF) gewonnen, die zusätzlich auch eine anthropometrische, physiologische und metabolische In-vivo-Phänotypisierung im Nüchternzustand, während eines oralen Glukosetoleranztestes (OGTT) sowie während einer euglykämischen-hyperinsulinämischen Clamp (Clamp) durchlaufen hatten. Die Satellitenzellen wurden isoliert, proliferiert und zu primären hMT differenziert, die 30 Minuten (0.5 h), 4 Stunden (4 h) oder 24 Stunden (24 h) mit 100 µM L-Carnitin und 125 µM [13C16]Palmitat stimuliert wurden. Intra- und extrazelluläre [12C]- und [13C]LPCs wurden isoliert und mittels Isotopenverdünnungsanalyse unter Einsatz von HPLC-ESI-Q-TOF-MS quantifiziert. Zellkulturen der hMTs wurden des Weiteren für die Bestimmung des mitochondrialen DNA (mtDNA)-Gehalts mittels Duplex-PCRs, der In-vitro-Expression wichtiger Gene des Fettsäurestoffwechsels mittels RT-qPCRs und der [3H]Palmitat-Oxidationsaktivität (FAO) mittels Flüssigszintillationsdetektormethodik eingesetzt.
Ergebnisse: Die massenspektrometrische Profilanalyse der LPC-Spezies führte zur Detektion von 20 [12C]-Spezies, von denen jeweils eine Spezies nur intra- bzw. extrazellulär auftrat, sowie von 7 [13C]-markierten Spezies. Die Konzentrationen der 7 [13C]-Spezies ([13C14]- bis [13C18]-enthaltende LPC-Spezies einschließlich LPC C16:1 und LPC C18:1) nahmen sowohl intra- als auch extrazellulär ausnahmslos ständig zu. Demgegenüber waren die meisten der [12C]-Spezies nach 24 Stunden in den Überständen und, in geringerem Maße, auch in den Zelllysaten erniedrigt. In der Folge zeigte sich die Gesamtsumme aller detektierten extrazellulären ([12C]- + [13C]-)Spezies nach 24 Stunden erniedrigt, wogegen die intrazelluläre Gesamtsumme nach 24 Stunden nicht signifikant verändert war. Die speziesspezifische Auswertung der zeitabhängigen Veränderungen der unmarkierten [12C]LPCs wies darauf hin, dass deren Kinetik sowohl von der Kettenlänge der Acylgruppe als auch von deren Ungesättigtheitsgrad (in Form der Anzahl an Doppelbindungen) beeinflusst wird: Die langkettigen vielfach ungesättigten Spezies LPC C20:3, LPC C20:4, LPC C20:5, LPC C22:4, LPC C22:5 und LPC C22:6 wiesen extrazellulär die ausgeprägtesten Abnahmen nach 24 Stunden und intrazellulär sogar Zunahmen nach 4 Stunden auf.
Bei den Korrelationsanalysen zwischen den In-vivo-Parametern der Spender und den In-vitro-LPC-Konzentrationen ergaben sich eine positive Assoziation von intrazellulärem LPC C18:0 mit Messgrößen der Fettleibigkeit und für die langkettigen vielfach ungesättigten LPC-Spezies positive Assoziationen mit der Kohlenhydratoxidationsaktivität während der Fließgleichgewichtsphase der Clamp (CHOxClamp) sowie negative Assoziationen mit der, sowohl durch den OGTT als auch durch die Clamp ermittelten, Insulinsensitivität. Die langkettigen vielfach ungesättigten LPC-Spezies korrelierten zudem positiv mit der In-vitro-FAO-Aktivität nach Stimulation mit [3H]Palmitat und negativ mit dem In-vitro-mtDNA-Gehalt. Außerdem zeigten sich für die meisten extrazellulären LPC-Spezies bemerkenswerte Korrelationen mit der FAO-Aktivität in hMTs, die mit dem PPARδ-Rezeptoragonisten GW501516 stimuliert worden waren.
Deutlich weniger signifikante Zusammenhänge wurden bei den radiomarkierten [13C]LPC-Spezies beobachtet.
Im Allgemeinen waren die In-vitro-[12C]- und -[13C]LPC-Konzentrationen infolge der metabolischen Beanspruchung durch [13C16]Palmitat sowohl mit der In-vitro-FAO-Aktivität infolge der Stimulation mit [3H]Palmitat als auch mit der In-vivo-CHOxClamp-Aktivität infolge der intravenösen Stimulation mit Insulin und Glukose überwiegend positiv assoziiert, weshalb LPCs eventuell als Gradmesser einer hohen metabolischen Flexibilität dienen könnten. Assoziationen mit während des Nüchternzustands ermittelten Parametern waren wesentlich seltener und schwächer.
Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieses Projekts verdeutlichen die Bedeutung der speziesspezifischen Profilanalyse bei Lipidquantifizierungen, da sich sowohl bei den Kinetiken als auch bei den Korrelationen beträchtliche Unterschiede zwischen den einzelnen Spezies ergaben. Langkettige vielfach ungesättigte LPC-Spezies wiesen die Kinetiken mit der größten Dynamik auf und zeigten auch die umfassendsten Korrelationen mit Parametern des Energiestoffwechsels, wobei niedrigere Konzentrationen auf eine beeinträchtigte metabolische Flexibilität hinweisen könnten.
Abstract:
Introduction: Lysophosphatidylcholines (LPCs) are considered as regulators of inflammation and atherosclerosis and increased intracellular and/or decreased circulating LPC concentrations have been multiply reported in obesity and insulin resistance. The aim of this study was to elucidate intracellular and extracellular LPC kinetics in primary human myotubes (hMT) after palmitate stimulation as correlate for an increased metabolic strain by free fatty acids and to reveal potential associations with in vivo characteristics of the donors and/or other in vitro results.
Methods: Myosatellite cells were obtained from muscle biopsies of the M. vastus lateralis from 12 lean, metabolically healthy participants of the Tübingen Family (TUEF) study involving anthropometric, physiologic and metabolic in vivo phenotyping of the donors in fasting condition, during an oral glucose tolerance test (OGTT) as well as during a euglycemic-hyperinsulinemic clamp (clamp). Myosatellite cells were isolated, proliferated and differentiated to primary hMTs which were stimulated for 30 minutes (0.5 h), 4 hours (4 h) or 24 hours (24 h) with 100 µM L-carnitine and 125 µM [13C16]palmitate. Intra- and extracellular [12C]- and [13C]LPCs were isolated and quantified by stable isotope dilution-based metabolomics analysis applying HPLC-ESI-Q-TOF-MS. Cultured hMTs were additionally used for investigation of mitochondrial DNA (mtDNA) content by duplex PCRs, of in vitro expression of important genes of fatty acid metabolism by RT-qPCRs and of [3H]palmitate oxidation (FAO) activity by liquid scintillation counting.
Results: Mass spectrometric LPC profiling revealed 20 [12C]-species, whereof in each case one was exclusively found intra- or extracellularly, and 7 [13C]-labeled species. Permanently increasing concentrations were observed for the 7 [13C]-species ([13C14]- to [13C18]-containing LPC species including LPC C16:1 and LPC C18:1) without exception both intra- and extracellularly. In contrast, most of the [12C]-species were decreased after 24 hours in the supernatants and, to a lesser extent, also in the cell lysates. As a consequence, the total sum of all detected extracellular ([12C]- + [13C]-) species was decreased after 24 hours, whereas the total intracellular sum was unchanged. Species-specific analyses of the time course changes of the unlabeled [12C]LPCs suggested an influence of both the length of the acyl group and its degree of unsaturation (in the form of the number of double bonds): The long-chain polyunsaturated species LPC C20:3, LPC C20:4, LPC C20:5, LPC C22:4, LPC C22:5 and LPC C22:6 showed extracellularly the most profound decreases after 24 hours and intracellularly even increases after 4 hours.
Correlation analyses between the in vivo parameters of the donors and the in vitro LPC concentrations revealed a positive association of intracellular LPC C18:0 with measures of obesity and for the long-chain polyunsaturated LPC species positive associations with carbohydrate oxidation activity determined during steady-state phase of the clamp (CHOxclamp) as well as negative associations with insulin sensitivity determined both during the OGTT and the clamp. Furthermore, the long-chain polyunsaturated LPC species correlated positively with in vitro FAO activity after stimulation with [3H]palmitate and negatively with in vitro mtDNA content. Additionally, remarkable correlations were found for most extracellular LPC species with FAO activity in hMTs stimulated with the PPARδ receptor agonist GW501516.
Markedly less significant relationships were observed for the radiolabeled [13C]LPC species.
In general, in vitro [12C]- and [13C]LPC levels determined in palmitate-strained condition were predominantly positively associated with both in vitro FAO activity after stimulation with [3H]palmitate and in vivo CHOxclamp after stimulation with intravenous insulin plus glucose suggesting them as an indicator of high metabolic flexibility. Associations with parameters determined during fasting condition were substantially rarer and weaker.
Conclusion: The results of this project underline the importance of species-specific lipid profiling as the individual species considerably differed in both the kinetics and the correlation results. The most dynamic kinetics were observed for long-chain polyunsaturated LPC species also showing the most encompassing correlations with parameters of energy metabolism with lower concentrations potentially pointing to an impaired metabolic flexibility.
LPC
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