The Assembly and Evaluation of Antisense Oligonucleotides Applied in Exon Skipping for Titin-based Mutations in Dilated Cardiomyopathy

Abstract

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine multifaktorielle Erkrankung; ca. 15-20% der familiären und 18% der sporadischen Formen lassen sich allerdings auf Mutationen im Titin, einem Sarkomerprotein mit wichtigen Funktionen für den kontraktilen Apparat, zurückführen. Im Moment steht keine spezifische Therapie für Patienten mit fortgeschrittener DCM zur Verfügung, sodass neben symptomatischen Maßnahmen mit Behandlung der Herzinsuffizienz lediglich die Option einer Herztransplantation existiert (Hahn et al.,2019). Ein potentieller Ansatz einer genotyp-spezifischen Therapie ist das sogenannte „Exon skipping“. Hierfür werden RNA-basierte Antisense-Oligonucleotide (AON) verwendet, um ein mutiertes Titin-Exon gezielt zu überspringen. Durch Wiederherstellung des Leserahmens entsteht ein verkürztes, aber funktionell intaktes Titin-Protein. In einer vorausgegangenen Machbarkeitsstudie haben wir das Prinzip des Exon-skippings an Zellkultur- und Mausmodell demonstrieren können. Das TTN-Gen besteht jedoch aus 363 Exonen und ist somit massiv; alle AON Sequenzen müssen deshalb für jedes einzelne Exon spezifisch entwickelt werden(Gramlich et al., 2015). Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, welches für das Design und die Evaluierung von AONs für ein effizientes Exon-Skipping spezifischer TTN-Exone angewandt werden kann. Zunächst werden verschiedene in silico Algorithmen beschrieben, die putative AON Sequenzen zum Überspringen eines Titin-Exons erstellen. Anschließend werden diese AONs in transfizierten HL-1 Zellen, einer murinen Kardiomyozytenlinie, getestet. Neben dem Nachweis eines korrekten Überspringens des Target- Exons mittels RT- PCR und Sanger-Sequenzierung werden die funktionellen Auswirkungen des skippings durch Immunhistochemie, Store-Operate-Calcium-Entry (SOCE) und Kontraktilitätsmessungen untersucht(Hahn et al.,2019). Diese Arbeit ist somit das erste systematische Protokoll zum AON-Design und deren Evaluation, um spezifische TTN Exons durch Antisense-Therapie zu überspringen. Dies ist ein erster Schritt in Richtung einer individualisierten Therapie für die titin-basierten dilatativen Kardiomyopathie(Hahn et al.,2019).