Intra- and intermolecular behavior of the Staphylococcus aureus virulence factor MprF and its effect on resistance against the antibiotic daptomycin

Abstract

Ein wichtiger Virulenzfaktor für bakterielle Pathogenität ist der Multiple Peptide Resistance Factor (MprF). Dieses Membranprotein stellt das positiv geladene Phospholipid Lysyl-Phosphatidylglycerol (LysPG) her, das bakterielle Resistenz gegen kationische antimikrobielle Peptide (KAMPs), KAMP-ähnliche Antibiotika und das humane Immunsystem verleiht. Diese Arbeit diente zur besseren Einordnung der Rolle MprFs in der Interaktion mit anderen Proteinen der Synthesemaschinerie von Membranlipiden. Zudem soll die Funktion von MprF näher untersucht werden, um eventuell neue potenzielle Ziele für antivirulente Therapeutika zu finden. Solche Inhibitoren könnten, im Gegensatz zu Antibiotika, die bekannt dafür sind, durch Selektionsdruck einen Vorteil zu erhalten, bakterielle Pathogene angreifbarer für unser Immunsystem machen und dadurch alternative Therapieoptionen liefern. Drei Aspekte von MprF wurden untersucht. Erstens wurde die Resistenz verglichen, welche durch mprF und mprFT345A gewährt wird. Es konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Duldung von DAP durch S. aureus mittels MprFs nicht auf einer geringeren Bindung von DAP basiert, was impliziert, dass es nicht auf verstärkter Ladungsabstoßung beruht. Zusätzlich schien eine oft beschriebene SNP (T345A) im ORF von mprF, welche zu erhöhter Resistenz gegen DAP führt, ebenso keine Änderung der Menge an zellgebundenem DAP zu zeigen. Dies deutet darauf hin, dass es – neben der bekannten Basisresistenz gegen KAMPs und KAMP-artige Antibiotika durch Ladungsabstoßung – einen weiteren Resistenzmechanismus gibt, der auf T345A beruht, spezifisch gegen Daptomycin und ohne Kreuzresistenz wirkt, und dass er vermutlich Änderungen vermittelt, wie DAP und die Zelloberfläche, die weniger PG enthält, interagieren. Zweitens wurden vermutete Interaktionen zwischen dlt und mprF untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass MprF und seine beiden Sub Domänen mit anderen Proteinen der LTA Synthesemaschinerie und der D Alanylierungsbahn interagieren, nämlich YpfP, LtaA, LtaS und DltD. Wenn dlt abgeschalten war und daher kein DltABCD System bestand, welches der Syntheseapparat für LTAs und Membranlipide ist, war interessanterweise MprF eigenständig nicht in der Lage, eine Resistenz gegen Polymyxin B zu gewähren. Dies impliziert eine Art von Abhängigkeit zwischen der Funktion von MprF und der Gegenwart von LTAs. Drittens wurden die Topologie und die Funktion von MprF detaillierter untersucht. indem es mit Cysteinresten markiert und selbige detektiert worden sind. An einer definierten Aminosäureposition innerhalb einer vorhergesagten Schleife von MprF wurden Cystein-Reste eingefügt. Indem diese Cystein-Reste detektiert wurden, konnte die Lokalisation der Schleife in der Membran abgeleitet werden. Die erweiterte zytoplasmatische Schleife (AS 245 298) der Flippasedomäne konnte an der äußeren Seite der Membran nachgewiesen werden. Jedoch, als die Synthasedomäne durch die SNP D731A deaktiviert wurde, konnte an der äußeren Seite der Membranschicht kein Signal mehr detektiert werden. Dies impliziert erstens, dass die oben genannte Schleife (AS 245 298) von der inneren an die äußere Seite der Membran flippt, und zweitens, dass dieses Flipping sich nur dann ereignet, wenn die Synthasedomäne von MprF intakt ist, was eine Abhägigkeit nahelegt zwischen dem Flipping der erweiterten Schleife und der Gegenwart des Substrates LysPG. Daher stellt diese Schleife möglicherweise das aktive Zentrum der MprF-Flippase dar.

An important virulence factor for bacterial pathogenicity is the Multiple Peptide Resistance Factor (MprF). This membrane protein produces the positively charged phospholipid lysyl phosphatidylglycerol (LysPG) that confers bacterial resistance against cationic antimicrobial peptides (CAMPs), CAMP-like antibiotics and the human immune system. This work served to better clarify MprF’s role in interaction with other proteins of the synthesis apparatus for membrane lipids. Furthermore, the function of MprF should be examined more in detail to possibly find new potential targets for antivirulent therapeutics. Such inhibitors, in contrast to antibiotics, could make bacterial pathogens more vulnerable for our immune system and therefore provide an alternative therapeutic option. Three aspects of MprF were looked into. For one thing, resistance conferred by mprF and mprFT345A was compared. It could be shown that the enhanced tolerance of S. aureus to DAP via MprF is not based on less binding of DAP, which implies that this is not due to an increased charge repulsion. Additionally, the often described SNP T345A in the ORF of mprF leading to increased resistance to DAP appeared to cause no change in the amount of cell bound DAP. This suggests that – besides the known basic resistance against CAMPs and CAMP like antibiotics via charge repulsion – there is another resistance mechanism which is conferred by T345A, specifically against DAP without cross-resistance, and is supposedly mediating alterations of how DAP and the cell surface with less PG interact. For another thing, assumed interactions between dlt and mprF were looked into. It could be shown that MprF and both its sub domains interact with other proteins of the lipoteichoic acid (LTA) synthesis machinery and the D alanylation pathway, namely YpfP, LtaA, LtaS and DltD. Interestingly, when dlt was knocked out and therefore the DltABCD system was not at hand, which is the synthesis apparatus for LTAs as membrane lipids, MprF alone was not able to confer resistance to polymyxin B. This implies some kind of dependence between the function of MprF and the presence of LTAs. Thirdly, the topology and function of MprF has been investigated in more detail. At a defined amino acid position within a predicted loop of MprF, cysteine residues were inserted. By detecting these cysteine residues, the localisation of the loop in the membrane could be deduced. The extended cytoplasmic loop (aa 245 298) of the flippase domain could be detected on the outer side of the membrane. But when disabling the synthase domain via SNP D731A, a signal on the outer side of the layer could not be detected any more. This implies, firstly, that the aforementioned loop (aa 245 298) flips from the inner to the outer side of the membrane and, secondly, that this flipping occurs only as long as the synthase domain of MprF is intact, suggesting a dependence between the flipping of the extended loop and the presence of the substrate LysPG. Therefore, this loop possibly depicts the active center of the MprF flippase.