CRISPR/Cas9-based correction of ELANE mutations in severe congenital neutropenia (CN) patients with no response to G-CSF and high risk to develop leukemia

Abstract

Die kongenitale Neutropenie (CN) ist ein monogener Knochenmarkdefekt mit einer Häufigkeitsrate von 1:200.000. CN ist gekennzeichnet durch eine absolute Neutrophilenzahl (ANC) von unter 500 Zellen pro Mikroliter. Aufgrund der niedrigen ANC erleiden Patienten mit CN schwere bakterielle Infektionen, die bereits früh nach der Geburt auftreten. Die Mechanismen, die zu einem "Ausreifungsstopp" bei CN führen, sind nicht vollständig aufgeklärt. Die therapeutischen Möglichkeiten für CN Patienten sind begrenzt und in einigen Fällen sind die verfügbaren Therapien sogar wirkungslos. Das Ziel dieser Arbeit war es daher neue und effiziente Alternativtherapien für diese Patienten zu entwickeln. Wir haben uns zunächst auf die Gruppe der CN-ELANE Patienten konzentriert, da die autosomal dominanten Mutationen in ELANE bei etwa 45% der Patienten beschrieben sind und damit die häufigsten, mit CN assoziierten Mutationen sind. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine beeinträchtigte Granulopoese bei CN-ELANE Patienten durch das Ausschalten des mutierten ELANE Gens wiederhergestellt werden könnte. Da mutiertes ELANE bei HSPCs von CN Patienten eine UPR (unfolded protein response) und einen Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) induziert, könnte das Ausschalten des ELANE Gens den "Reifungsstopp" der Granulopoese aufheben. Um unsere Hypothese experimentell zu überprüfen, führten wir einen CRISPR/Cas9 RNP-basierten Knockout von ELANE in iPSCs und HSPCs von CN Patienten sowie in gesunde Kontrollen durch, gefolgt von einer granulozytären Differenzierung in vitro. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der CRISPR/Cas9 RNP-basierte ELANE Knockout die granulozytäre Differenzierung von HSPCS von CN Patienten signifikant erhöhte und in vitro voll funktionsfähige reife Neutrophile erzeugte. Daher könnte ein CRISPR/Cas9-basierter ELANE Knockout bei CN-ELANE Patienten eine wirksame, sichere, virus- und DNA-freie, universelle Therapieoption sein, insbesondere bei Patienten, die nicht auf G-CSF ansprechen oder hohe G-CSF Dosierungen für ihre Therapie benötigen. Auch solche Patienten, bei denen die Knochenmarktransplantation versagt hat, könnten von dieser neuen Therapie profitieren. Im zweiten Teil der Arbeit entwickelten wir Strategien zur Verbesserung der Effizienz der sicheren Gen-Editierung in primären menschlichen Zellen. In diesem Zusammenhang haben wir eine Methode entwickelt, um CRISPR/Cas9 RNP mittels Fluoreszenz zu markieren, so dass die gewünschte Zellpopulation anschließend durch FACS angereichert werden kann. Diesen Ansatz testeten wir dann an Genen, deren Transkripte selten sind und deren Expression Kontext-abhängig ist. Auf diese Weise gelang es uns GADD45B (growth arrest and DNA-damage inducible β), in schwer zu transfizierenden Leukämie-Zelllinien und primären humanen iPSCs, zu deletieren. Durch die Verwendung angereicherter GADD45B Knockout Zellen konnten wir nachfolgend funktionelle Untersuchungen durchführen. Zuletzt konzentrierten wir uns auf die Analyse der Signaltransduktion, welche die hämatopoetische Differenzierung und leukämogene Transformation hämatopoetischer Stammzellen steuert. Wir untersuchten in diesem Kontext die Rolle der NAMPT-vermittelten Deacetylierung des Transkriptionsfaktors LMO2 in der Hämatopoese und der Leukämogenese. Wir konnten zeigen, dass die Deacetylierung des LMO2 Proteins für die Bildung von Blutzellen sowie die Proliferation und das Überleben von T-ALL Blasten in vitro und in vivo entscheidend ist. Unsere Untersuchungen zeigen, dass NAMPT und SIRT2 eine wesentliche Rolle bei der Deacetylierung und damit der Aktivierung von LMO2 spielen. Darüber hinaus könnten wir zeigen, dass die Hemmung der NAMPT/SIRT2-vermittelten LMO2 Deacetylierung, durch die selektiven Inhibitoren, das Wachstum von T-ALL Zellen reduziert und deren Apoptose beschleunigt, in vitro und in vivo. Basierend darauf könnte die Inhibition der NAMPT/SIRT2-vermittelten LMO2 Deacetylierung in Zukunft ein therapeutischer Ansatz zur Behandlung der T-ALL sein.

Severe congenital neutropenia (CN) is a monogenic bone marrow failure syndrome with an occurrence of 1:200,000. CN is characterized by an absolute neutrophil count (ANC) below 500 cells per microliter. Due to low ANC, patients with CN suffer from severe, fatal bacterial infections starting early after birth. The mechanisms that lead to "maturation arrest" in CN are not fully elucidated. Therapeutic options for CN patients are limited and, in some cases, not available. We aimed to design and develop novel and efficient alternative therapies for these patients. We first focused on CN-ELANE patients because autosomal dominant mutations in ELANE are the main disease-causing reason in approximately 45% of CN patients. We hypothesized that impaired granulopoiesis in CN patients could be restored by knockout of mutated ELANE. As mutated ELANE induces unfolded protein response (UPR) and endoplasmic reticulum (ER) stress in HSPCs of CN patients, ELANE knockout might restore a "maturation arrest" of granulopoiesis. To evaluate this hypothesis, we performed CRISPR/Cas9 RNP based knockout of ELANE in iPSCs and HSPCs of CN patients as well as healthy controls followed by in vitro granulocytic differentiation. Our results showed that CRISPR/Cas9 RNP based ELANE knockout significantly increased granulocytic differentiation resulting in the generation of fully functional mature neutrophils in vitro. Therefore, CRISPR/Cas9 based ELANE knockout in CN-ELANE patients might be an effective, safe, virus-, and DNA-free universal therapy option for CN. It is particularly true for patients who are G-CSF non-responders or needing high G-CSF dosages and for patients with unsuccessful bone marrow transplantation. We further addressed the challenges of gene-editing in primary human HSPCs or iPSCs and investigated the strategies to improve the efficiency of the safe gene-editing in these cells. In this regard, we established a method of fluorescently labeling of CRISPR/Cas9 RNP and thus enriching the edited cell population by fluorescent activated cell sorting (FACS). We tested the applicability of our approach for genes with low-abundance transcripts and context-dependent inducible expression. Thus, we successfully deleted growth arrest and DNA-damage-inducible β (GADD45B) gene in the hard-to-transfect leukemia cell line, primary human HSPCs, and human iPSCs. We were able to perform downstream functional studies using enriched GADD45B knockout cells. Lastly, we focused on the analysis of the signal transduction pathways operating during hematopoietic differentiation and the leukemogenic transformation of HSPCs. Particularly, we studied the role of NAMPT - mediated deacetylation of the LIM domain only 2 (LMO2) transcription factor in hematopoiesis and leukemogenesis. We found that the deacetylation of LMO2 protein is crucial for the blood cell formation but also proliferation and survival of T-ALL blasts in vitro and in vivo. Our investigations elucidated that NAMPT and SIRT2 play an essential role in the activation of LMO2 by deacetylation. Moreover, inhibition of the NAMPT/SIRT2 - mediated LMO2 deacetylation pathway by selective small molecule inhibitors led to reduced proliferation and elevated apoptosis of T-ALL cells in vitro and in vivo. Thus, inhibition of NAMPT/SIRT2 deacetylation of LMO2 might be further elaborated as a therapeutic approach for T-ALL patients.