Modifikation von Zellen mit synthetischer mRNA für Anwendungen im Bereich der Regenerativen Medizin

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URI: http://hdl.handle.net/10900/113628
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1136289
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-55004
Dokumentart: Dissertation
Date: 2021-03-26
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Avci-Adali, Meltem (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2021-01-14
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
610 - Medicine and health
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
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Inhaltszusammenfassung:

Ein wichtiger Bestandteil der regenerativen Medizin sind Zelltherapien. Die transplantierten Zellen können sich in das verletze Gewebe integrieren und dort körpereigene Reparatur- und Regenerationsmechanismen anregen. Somit kann es zur Heilung des geschädigten Gewebes und Organen kommen. Limitierungen, wie der Mangel an patientenspezifischem Zellmaterial, die Überlebens- und Integrationsfähigkeit nach Transplantation, können durch Modifikation der Zellen überwunden werden. Das Proteinexpressionsprofil der Zellen wird dabei verändert, um ihre natürliche Aktivität zu verbessern oder ihre zelluläre Entwicklung zu verändern. Die RNA-basierte Modifikation von Zellen stellt eine vielversprechende Methode für therapeutische Anwendungen dar, da die Expression von gewünschten Proteinen Integrations- und Rückstands-frei erfolgt. Die Bildung neuer Blutgefäße in ischämischem Gewebe, z. B. nach einem Myokardinfarkt, kann die Regeneration und Funktion der Organe verbessern. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit synthetisch modifizierte mRNAs, die für VEGF-A, ANG-1 und SDF-1α kodieren, in murine endotheliale Progenitorzellen (EPCs) transfiziert, um das natürliche angiogenetische Potenzial der EPCs zu fördern. Dabei zeigte die Analyse typischer Parameter zur Gefäßbildung, wie die chemotaktische Migration, die Wundheilungskapazität, die in vitro und in vivo Gefäßneubildung, ein verbessertes angiogenetisches Potenzial der mRNA-modifizierten EPCs im Vergleich zu unbehandelten EPCs. Insbesondere die EPCs, die mit ANG-1 mRNA oder gleichzeitig mit allen 3 mRNAs (VEGF-A, ANG-1 und SDF-1α) transfiziert wurden zeigten signifikant verstärkte proangiogene Eigenschaften. Auf diese Weise veränderte Zellen könnten somit nach einer Transplantation zur Verbesserung der Blutversorgung in geschädigtem oder ischämischem Gewebe führen. Induziert pluripotente Stammzellen (iPSCs) können als unendliche patientenspezifische Quelle für verschiedene Zellarten dienen. Hierfür können iPSCs durch Differenzierung in gewünschte Zelltypen für zukünftige therapeutische Applikationen generiert werden. Für die nichtintegrative Reprogrammierung von neonatalen Fibroblasten in iPSCs wurde ein mRNA-basierter Ansatz mit einem selbst-replizierenden RNA (srRNA)-basierten Ansatz verglichen. Die generierten iPSCs wiesen typische Charakteristika der pluripotenten Stammzellen auf und waren in der Lage in alle 3 embryonalen Keimblätter (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) zu differenzieren. In den iPSCs wurden keine srRNA-Rückstände oder chromosomale Abnormalitäten festgestellt. Daher sind die so generierten Zellen besonders gut für den therapeutischen Einsatz geeignet. Die Reprogrammierung der Zellen konnte durch eine einmalige srRNA Transfektion durchgeführt werden. Weiterhin stellte sich heraus, dass die Reprogrammierung mittels srRNA effizienter, kostengünstiger und mit weniger Arbeitsaufwand verbunden war als die tägliche Transfektion der Zellen mit mehreren mRNAs. Nach der erfolgreichen Etablierung des srRNA-basierten Protokolls zur Herstellung von iPSCs wurden auch adulte Zellen reprogrammiert. Dazu wurden einerseits renale Epithelzellen (RECs) nicht-invasiv aus Urin gewonnen und andererseits Zellen aus Kieferperiost (JPCs) xeno-frei isoliert. Nach Bestätigung der Pluripotenz, der Differenzierungsfähigkeit in die 3 Keimblätter in vitro und in vivo und der Eliminierung der srRNA, wurden die iPSCs zu gewebespezifischen Zellen differenziert und erfolgreich auf ihre spezifische Markerexpression untersucht. Die REC-iPSCs wurden innerhalb von 10 Tagen zu schlagenden Kardiomyozyten differenziert und anhand einer Video-basierten Analyse von Ca2+ Intermediaten wurde die Kontraktilität der generierten Zellen bestätigt. Die Behandlung der generierten Kardiomyozyten mit dem Aktivator Isoproterenol führte zur Erhöhung der Schlagrate und die Inhibitor-Behandlung mit Nifidipin bewirkte die Hemmung der Kontraktionen in den Zellen. Die JPC-iPSCs wurden zuerst in induziert mesenchymale Stamm/ Stroma-ähnliche Zellen (iMSCs) und dann weiter zu osteogenen Zellen differenziert, die eine starke Mineralisierung aufwiesen. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit verschiedene Hydrogele bezüglich der mRNA Freisetzung über einen längeren Zeitraum hinweg untersucht, um die transiente mRNA vermittelte Produktion von Proteinen zu verlängern. Chitosan-Alginat-Hydrogele zeigten eine verzögerte Freisetzung von Cyanin 3-markierter Luciferase (Cy3-hGluc) mRNA über 3 Wochen. Die Bioaktivität der freigesetzten hGLuc mRNAs und die anhaltende Proteinexpression konnten durch die Produktion der Luziferase, vermittelt durch die in die mRNA Hydrogele integrierten HEK293 Zellen und die Messung der Luziferase-Aktivität über 21 Tage bestätigt werden. Rheologische Messungen zeigten stabile gelartige Eigenschaften der mit mRNA beladenen Hydrogele über den Zeitraum von 3 Wochen. Somit konnte durch die verzögerte Freisetzung der mRNAs aus dem Hydrogel, die Proteinexpression in den Zellen verlängert werden ohne die mRNA mehrfach applizieren zu müssen. Der Einsatz von nicht Genom-integrierenden RNAs zur gezielten Überexpression spezifischer Proteine in patientenspezifischen Zellen eröffnet enorme Möglichkeiten im Bereich der regenerativen Medizin und des Tissue Engineerings. So können mittels mRNA oder srRNA modifizierte autologe Zellen zur Zelltherapie oder Generierung 3-dimensionaler Gewebekonstrukte eingesetzt werden und so eine personalisierte Therapie und Regeneration von Geweben ermöglichen.

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