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Bereits kurz nach seiner Entdeckung im Jahre 1984 stellte sich heraus, dass das 23-gliedrige Polyketid-Makrolid Tacrolimus (FK506) ein sehr wirksames Immunsuppressivum ist. Mittlerweile ist Tacrolimus das wichtigste Medikament zur Verhinderung von Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen von beispielsweise Leber und Niere. Der Naturstoff wird von Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 und verwandten Stämmen produziert, wobei die Biosynthese auf ein TypI PKS/NRPS-System zurückzuführen ist. Der Biosyntheseweg, der zur Produktion von Tacrolimus führt, wurde in vorausgehenden Studien detailliert untersucht und ermöglichte die Identifizierung von zwei Cluster-spezifischen Regulatoren, FkbN und FkbR. Jedoch ist bisher wenig bekannt über globale Regulatoren, welche die Biosynthese dieses bedeutenden Immunsuppressivums beeinflussen.
In dieser Arbeit sollte die Regulation der Tacrolimus-Biosynthese untersucht werden. Hierzu wurde ein sogenannter DNA affinity capturing assay (DACA) durchgeführt, um Proteine zu identifizieren, die spezifisch an Promoter-Regionen des Tacrolimus Biosynthese-Genclusters binden. Insgesamt wurden 1044 Proteine im DACA nachgewiesen, die an die Promoter-Regionen Ptcs6, PfkbO, PfkbG, PallA und das Fragment der Negativkontrolle, P16S, gebunden hatten. 40 dieser Proteine wurden daraufhin für weitere Untersuchungen ausgewählt, da sie spezifisch an eine der Promoter-Regionen im Biosynthese Gencluster gebunden hatten. Nachdem diese Proteine einzeln in einem nicht-integrativen System im Wildtyp-Produzenten Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 überexprimiert worden waren, zeigte sich, dass 14 dieser 40 Proteine die Tacrolimus-Produktion signifikant erhöht hatten. Eine maximale Tacrolimus-Ausbeute wurde durch Überexpression einer Zweikomponenten-Sensorhistidinkinase beobachtet, die am Promoter-Fragment Ptcs6 identifiziert worden war (2,25-fache Produktionssteigerung). Eine nachfolgend durchgeführte, umfassende Analyse unter Einbeziehung von sieben der vorab identifizierten Protein-Kandidaten, welche an verschiedene Promoter-Bereiche binden, zielte darauf ab, einen möglichen Unterschied zwischen integrativer und nicht-integrativer Überexpression der jeweiligen Regulator-Gene in Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 aufzudecken. Diese Untersuchung offenbarte einen Dosis-Wirkungs-Effekt einiger Regulator-Proteine und verdeutlichte, dass die Überexpression gewisser Regulatoren, wie beispielsweise FkbN, unter integrativen Bedingungen begünstigt ist. Um die Tacrolimus-Produktion auf regulatorischem Level weiter zu erhöhen, sollten in einem weiteren Ansatz einige der zuvor identifizierten, vielversprechendsten Regulator-Proteine gemeinsam integrativ überexprimiert werden. Eine gemeinsame Überexpression der bereits erwähnten Sensorhistidinkinase mit einem Transkriptionsregulator der TetR-Familie ermöglichte eine 3,2-fache Erhöhung der Tacrolimus-Produktion in Streptomyces tsukubaensis NRRL18488.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand in der biosynthetischen Herstellung von Tacrolimus-Derivaten. Um Tacrolimus-Derivate mit einer 9-Allyl- bzw. 9-Ethyl-Gruppe herzustellen, die möglicherweise als FKBP-51-Inhibitoren fungieren könnten, wurden drei verschiedene PKS-Engineering-Ansätze verfolgt. Alle drei Ansätze zielten darauf ab, Modul 10 innerhalb des PKS-Systems zu modifizieren, um somit gezielt die Position 9 des Tacrolimus-Moleküls zu verändern. Um das gewünschte 9-Allyl-Derivat herzustellen, wurden ein Modul-Austausch und ein AT-Domänen-Austausch vorgenommen, jeweils in der Absicht, die promiskuitive AT-Domäne von Modul 4 des FK506 PKS-Systems in Modul 10 einzufügen. Obwohl diese Ansätze dazu führten, dass die Tacrolimus-Produktion in Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 und dem heterologen Produzentenstamm Streptomyces coelicolor verringert wurde, konnte eine Produktion des gewünschten Derivats nicht nachgewiesen werden, möglicherweise aufgrund eines Mangels der Allylmalonyl-CoA-Vorläuferverbindung. Die dritte PKS-Engineering-Strategie beabsichtigte einen ACP-Domänen-Austausch. Die ACP-Domäne von Modul 10 sollte durch die ACP5-Domäne des Kirromycin-Biosynthese-Genclusters ersetzt werden. Basierend auf dem Wissen, dass die KirACP5 durch die transAT KirCII spezifisch mit Ethylmalonyl-CoA beladen wird, sollte dieser Ansatz es prinzipiell ermöglichen, 9-Ethyl-Tacrolimus herzustellen, indem die transAT KirCII in den Mutanten mit ausgetauschter ACP-Domäne exprimiert wird. Obwohl nachweislich kein Tacrolimus mehr von den hergestellten Mutanten mit KirACP5-Domäne produziert wurde, konnte eine Produktion des 9-Ethyl-Derivats weder in Streptomyces tsukubaensis NRRL18488-Mutanten noch in heterologen Streptomyces coelicolor-Mutanten nachgewiesen werden. Allerdings produzierte eine der hergestellten Mutanten mit ACP-Domänen-Austausch unerwarteterweise 9-Deoxo-31-O-demethyl FK506, ein bekanntes Intermediat der Tacrolimus-Biosynthese. |
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