Hyphenation of capillary isotachophoresis and capillary electrophoresis-mass spectrometry for online preconcentration and separation of amino acids

Abstract

Die Kopplung der Isotachophorese mit Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (ITP/CE-MS) bietet eine Möglichkeit zur Verbesserung der Nachweisgrenzen bei CE-MS Analysen, die aufgrund des geringen Injektionsvolumens häufig unzureichend sind. Obgleich die Kombination von transienter Isotachophorese mit CE-MS häufig angewendet wird, wird die zweidimensionale ITP/CE-MS-Kopplung noch kaum verwendet. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene 2D-ITP/CE-MS-Setups vorgestellt, die auf der Kombination eines maßgeschneiderten mikrofluidischen Glaschip-Interfaces mit kommerziellen Kapillaren basieren. Für die simultane Aufkonzentration der proteinogenen Aminosäuren als Kationen innerhalb einer isotachophoretischen Zone wurden hydroorganische Elektrolytsysteme mit hoher MS-Kompatibilität und Toleranz für wässrige Proben entwickelt. Imidazol wurde als Leition verwendet und H+ diente als Folgeion, während entweder Trimethylbrenztraubensäure oder Difluoressigsäure als Gegenionen genutzt wurden, um ausreichend niedrige pH-Werte zu erhalten. Mittels direkter ITP-MS-Kopplung wurden mit diesen Elektrolytsystemen Nachweisgrenzen im niedrigen mikromolaren Bereich erhalten. Bis zu 30 % der Kapillare konnten mit Proben in Konzentrationen unter 1 µmol/L beladen werden. Für CE-MS wurde ein hydroorganischer (Isopropanol/Wasser) Essigsäure-Hintergrundelektrolyt sowohl für eine hohe MS-Kompatibilität als auch für die Kompatibilität mit den ITP-Elektrolyten in der 2D-Kopplung optimiert. Trennungen in diesem BGE boten eine ausreichende Trenneffizienz und Auflösung für die qualitative Bestimmung aller Analyte. Nachweisgrenzen lagen im mikromolaren Bereich. Der Einfluss hydroorganischer BGEs auf den elektroosmotischen Fluss und die effektive elektrophoretische Mobilität der Analyte wurde in BGEs untersucht, die 10-30 % Isopropanol, Dimethylsulfoxid oder Acetonitril oder 10-50 % Methanol enthielten. Die Ergebnisse zeigten keine Änderungen der Trennselektivität. Lösungsmittelparameter wie z.B. die relative Permittivität und die relative Viskosität reichten nicht aus, um die Einflüsse auf elektroosmotischen Fluss und effektive elektrophoretische Mobilitäten verlässlich vorherzusagen. Die neu entwickelten Elektrolyte wurden in einem Kapillar-Kopplungs-ITP/CE-MS-Setup mit mikrofluidischem Glaschip-Interface unter Verwendung eines eigens angefertigten Vialhandlers mit externer Hochspannungsquelle als zweitem CE-Gerät verwendet. Mangels Detektionsmöglichkeit an der Schnittstelle der beiden Dimensionen erwies sich der Probentransfer als schwierig. In einem Einkapillar-ITP/CE-MS-Setup wurde über ein T-Stück aus geätztem Glas eine Seitenkapillare ergänzt, die der Erzeugung des Rückflusses zum Rücktransport des ITP Stacks diente. Mit diesem Aufbau ist die Wahl der Elektrolyte unabhängig von der Zusammensetzung des Sheath Liquids, welches in anderen Publikationen zur Rückflussgeneration verwendet wurde. In dieser Arbeit konnte erstmals ein Aufbau für 2D-Trennungen etabliert werden, mit dem alle drei möglichen Modi, nämlich L-S-L, T-S-T und BGE-S-BGE, genutzt werden konnten. Die Rückflussbedingungen und Kapillarlängen wurden optimiert, um einen vollständigen Probentransfer und dadurch bestmögliche Trennbedingungen in der zweiten Dimension zu erhalten. Enzymatische Verdaue von Rinderserumalbumin mit Trypsin, Lys-C, Lys-N oder Glu-C nach dem gleichen Protokoll wurden mit CE-MS analysiert. Entgegen der Erwartung, dass andere Proteasen als Trypsin für nachfolgende CE-MS-Analysen von Peptiden besser geeignet sind, lieferte Lys-C ähnliche Ergebnisse wie Trypsin, obwohl keine Spaltung an Arginin stattfand, weshalb höhere Ladungen an den generierten Peptiden erwartet wurden. Die Ergebnisse für Verdaue mit Lys-N und Glu-C waren tryptischen Verdauen unterlegen.

The hyphenation of isotachophoresis with capillary electrophoresis-mass spectrometry (ITP/CE-MS) is considered to improve the detection limits in CE-MS analyses which are often insufficient due to the low sample injection volumes. Although the combination of transient isotachophoresis with CE-MS is commonly applied, the two-dimensional ITP/CE-MS hyphenation is still scarcely used. In this work, two different 2D ITP/CE-MS setups based on a combination of a custom-made microfluidic glass chip interface with commercial capillaries are presented. Hydroorganic electrolyte systems with high MS-compatibility and tolerance for aqueous samples were developed for the simultaneous preconcentration of the proteinogenic amino acids as cations within one isotachophoretic zone. New electrolyte systems included imidazole as leading ion and H+ as terminating ion, while either trimethylpyruvic acid or difluoroacetic acid were applied as counterions to obtain sufficiently low pH values. In direct ITP-MS analyses, detection limits in the low micromolar range were obtained. Up to 30 % of the capillary could be filled with sample at concentrations below 1 µmol/L. For CE-MS, a hydroorganic (isopropanol/water) acetic acid background electrolyte was optimized for both, high MS-compatibility and compatibility with the ITP electrolytes in 2D hyphenations. Sufficient separation efficiency and resolution for qualitative determinations of all analytes were obtained with detection limits in the micromolar range. The influence of hydroorganic BGEs on the electroosmotic flow and effective electrophoretic mobilities of the analytes was investigated in BGEs containing 10-30 % isopropanol, dimethyl sulfoxide or acetonitrile or 10-50 % methanol. No changes in selectivity were observed and results indicate that solvent parameters such as e.g. relative permittivity and relative viscosity are not sufficient to describe and predict CE separations. The new electrolyte systems were applied in a capillary coupling ITP/CE-MS setup, using a home-made vial-handler with an external high voltage source for second dimension. Sample transfer proved difficult due to a lack of an intermediate detector. In a single capillary ITP/CE-MS setup, a side capillary was introduced for counterflow generation. With this setup, the choice of electrolytes becomes independent from the sheath liquid, which was used for counterflow generation in other publications. This work shows the applicability of L-S-L, T-S-T and BGE-S-BGE modes in a single capillary setup for the first time. Counterflow conditions and capillary lengths were optimized for optimal sample transfer to obtain best separation conditions. Digests of bovine serum albumin with trypsin, Lys-C, Lys-N or Glu-C following the same protocol were analyzed with CE-MS. The expectation that proteases other than trypsin are better suited for subsequent CE-MS analyses of peptides was not fulfilled as Lys-C provided similar results as trypsin, although it was expected to result in higher peptide charges as it only cleaves the protein at lysine sites. Results obtained for digests with Lys-N and Glu-C were inferior to trypsin.