Development of a Fluorescent Probe Applicable for Screening New Inhibitors Targeting Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 4 (MKK4)

Abstract

In den letzten Jahren ist die Anzahl an Patienten, welche unter chronischen Lebererkrankungen leiden, konstant gestiegen. Obwohl die Leber das einzige Organ darstellt, welches sich nach Gewebeschädigung in Kürze komplett regenerieren kann, ist dies nur bis zu einem bestimmten Anteil an verbleibendem gesundem Lebergewebe möglich. MKK4 wurde dabei als Schlüsselregulator der Leberregeneration identifiziert. Unter Laborbedingungen konnte eine direkte Korrelation zwischen reduzierter Protein-Expression von MKK4 mit shRNA und einer erhöhten Regenerationsfähigkeit der Hepatozyten gezeigt werden. Zeitgleich wurde mit dem BRAF-Inhibitor Vemurafenib ein Startpunkt gefunden, welcher MKK4 als off-target bindet. Bis heute gibt es jedoch nur wenige veröffentlichte Inhibitoren mit guter Selektivität für MKK4, was den dringenden Bedarf an neuen Strukturklassen zu Adressierung von MKK4 unterstreicht. Diese Lücke kann mit der Identifizierung neuer Inhibitoren für MKK4 in einem Fluoreszenzpolarisations-basierten Hochdurchsatz-Screening geschlossen werden. Dafür bedarf es der Entwicklung einer fluoreszenten Sonde zur Adressierung von MKK4 in einem entsprechenden Assay. Diesbezüglich wurden zwei parallele Synthesestrategien verfolgt, welche auf strukturell verwandten Grundgerüsten des Vemurafenibs, Azaindol und Carbolin, basieren. Mit Hilfe von Linker-Systemen, welche sich in Länge, Basis und Positionierung des Fluoreszenzfarbstoffes am Grundgerüst unterscheiden, konnte die Carbolin-basierte Verbindung 55 entwickelt werden, welche eine hohe Affinität (POC = 1.3, Konz. 100 nM) und Inhibition (IC50 = 1.03 μM) zu MKK4 zeigte. Mit Hilfe dieser fluoreszenten Sonde konnten bekannte MKK4 Inhibitoren in ihrer Potenz bestätigt werden. Außerdem war diese Verbindung fähig neue Strukturklassen in einem HT-screening zu finden, welche zur Weiterentwicklung neuer Inhibitoren geeignet sind. Die gefundenen Hits wurden in einem zweiten Assay bestätigt und anhand ihrer synthetischen Zugänglichkeit, Struktur und Stabilität bewertet. Diese zwei Hits, welche ein Aminopyrimidin- und ein Imidazol-Grundgerüst enthalten, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Für beide Verbindungen konnte eine zugängliche Synthese etabliert werden, die in kurzer Zeit eine ZUSAMMENFASSUNG VIII hohe Anzahl an Derivaten zuließ, welche Aussagen über den Bindemodus der Kinase erlaubten. Besonders Verbindung 142 hob sich durch eine hohe Bindeaffinität zu MKK4 (POC = 26) hervor, welche sich im gleichen Bereich wie Vemurafenib bewegt und ist trotz bekanntem Imidazol Strukturmotiv eine neue Substanzklasse zur Inhibition von MKK4. Diese Ergebnisse ebenen den Weg für die Entwicklung neuer Leitstrukturen zur Adressierung von MKK4.