Inhaltszusammenfassung:
Beim Neuroblastom handelt es sich um den häufigsten soliden extrakraniellen Tumor im Kindesalter, die Rate an Neuerkrankungen in Deutschland beträgt ca. 120 pro Jahr. Trotz intensiver Therapieschemata mit multimodalen Konzepten haben Patienten mit metastasiertem Tumorstadium oder genetischen Risikofaktoren eine ungünstige Prognose.
Ein multimodales Therapiekonzept bestehend aus (neo-)adjuvanter Chemotherapie, chirurgischer Resektion, MIBG- und Bestrahlungstherapie sowie haploidenter Stammzelltransplantation mit nachfolgender GD2-Antikörpertherapie (Dinutuximab beta ch14.18/CHO) und IL-2 Immunstimulation verbessern das 5 Jahresüberleben von Patienten mit rezidiviertem Neuroblastom Stadium IV (MRD-negativ vor Transplantation) von etwa 20% bei alleiniger haploidenter Stammzelltransplantation auf über 50%. Die entscheidende Rolle für die Verbesserung des Überlebens nimmt die an die haploidente SZT anschließende Therapie mit dem chimären GD2-Antikörper. Die Antikörpervermittelte Rekrutierung von NK-Zellen führt zu einer besseren Rezidivkontrolle da sie minimale, durch die vorhergehende Therapie nicht eradizierte Tumorherde eliminiert.
NK-Zellen sind ein Teil des angeborenen Immunsystems und spielen eine zentrale Rolle in der Abwehr infizierter oder entarteter Zellen. Neuroblastomzellen sind sehr empfänglich für die NK-vermittelte Lyse. Durch den Einsatz von GD2-Antikörpern kann der antitumorale Effekt signifikant gesteigert werden.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit lag die Untersuchung des Einflusses aktivierender und inhibierender Rezeptoren auf die in vitro Aktivität frisch isolierter PBMC und expandierter NK- und γδT-Zellen gegen 8 verschiedene Neuroblastomzelllinien. Unser Expansionsprotokoll gewährleistete eine qualitativ und quantitativ hochwertige Expansion von NK-Zellen mit stabilem KIR Immunphänotyp. Der KIR Immunphänotyp war die Grundlage für die funktionelle Testung frisch isolierter PBMC und expandierter NK-Zellen in KIR R/L Match und Mismatch Situationen, welche nach allogener und insbesondere haploidenter Stammzelltransplantationen vorkommen. Dabei wurden die Major KIR Rezeptoren KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 und KIR3DL1 mit ihren korrespondierenden Liganden HLA C1, C2 und Bw4 berücksichtigt. Es konnte eine gesteigerte NK-Aktivität bei KIR RL Mismatch verglichen mit KIR RL Match gezeigt werden. Folglich hat die KIR-HLA I Interaktion einen Einfluss auf die NK-vermittelte Lyse von Neuroblastomzellen. Jedoch war zu beobachten, dass die Aktivität der NK-Zellen stärker von spenderspezifischen Eigenschaften abhängig ist als von einem eventuell vorhandenen KIR RL Mismatch.
Die verschiedenen NK-Alloreaktivitätsmodelle waren nur eingeschränkt geeignet, um eine Vorhersage über die NK-vermittelte Lyse zu treffen. Beim Ligand-Ligand Modell wird ausschließlich anhand der HLA-Genotypisierung von Spender und Empfänger (Hier: Tumorzellen) auf deren KIR Repertoire geschlossen und anhand dessen die Alloreaktivität vorhergesagt. In unserer Untersuchung erwies sich dieses Modell als unzureichend. Ebenfalls war das RL Modell ungenau in der Vorhersage der NK-Alloreaktivität, da bei der Untersuchung des Immunphänotyps der NK-Zellen eine Diskrepanz zwischen HLA-Genotypisierung und der reellen Expression der HLA I Liganden auf einigen der Neuroblastomzelllinien auffiel. Folglich sollte neben der HLA-Genotypisierung immer auch eine Untersuchung des HLA I Phänotyps erfolgen, um die NK-Alloreaktivität besser vorhersagen zu können. Jedoch sind aktuell keine Antikörper zur Unterscheidung aller HLA C Untergruppen verfügbar. Daher konnten wir in der vorliegenden Arbeit nur die HLA Gruppe B Liganden mittels Antikörper unterscheiden und untersuchen.
Aktivierende Liganden für die NKG2D und DNAM-1 Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle für die NK-vermittelte Lyse der Neuroblastomzelllinien. Eine Blockade der Rezeptoren führt zu einer signifikant verminderten Lyse. Die Aktivierung der NK-Zellen durch NKG2D/DNAM-1 Liganden scheint im Vergleich zur HLA Klasse I vermittelten Inhibition eine übergeordnete Rolle einzunehmen.
Die Anwendung des therapeutischen Antikörpers ch14.18 bewirkte spenderunabhängig eine signifikante Steigerung der Lyse. Gleichzeitig wird der Einfluss der aktivierenden Liganden auf die NK-vermittelte Lyse durch den GD2-Antikörper verringert. Dies ist für Patienten mit geringer Expression von aktivierenden Liganden bzw. geringer intrinsischer NK-Aktivität eine gute Nachricht, da sie ebenfalls von einer GD2-Antikörpertherapie profitieren können.
γδT-Zellen sind potente Effektorzellen, die sich ebenfalls wie NK-Zellen durch Antikörper stimulieren lassen. Insbesondere die gegenseitige Beeinflussung von γδT-Zellen und NK-Zellen ist sowohl in vitro als auch in vivo von Bedeutung für die Abwehr von maligne entarteten Zellen. Da γδT-Zellen im Gegensatz zu αβT-Zellen ihre Targetzellen MHC unabhängig erkennen können, lösen sie keine Graft-vs-Host-Disease aus. Dies macht γδT-Zellen im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantationen besonders interessant.
Abschließend hat sich gezeigt, dass sich die Spender kategorisch in „gute“ und „schlechte“ Spender einteilen lassen. Interessanterweise bleiben diese Kategorien zwischen den einzelnen Zelllinien und sogar bei der gänzlich anderen Tumorentität der kindlichen ALL erhalten. Sollte sich diese Beobachtung in weiteren Untersuchungen bestätigen könnte die Spenderauswahl in der klinischen Praxis stark vereinfacht werden, indem die verfügbaren Spender mittels funktioneller Testung evaluiert und anhand objektivierbarer Effektorfunktion der beste Spender identifiziert werden.
Für die Behandlung solider Tumoren wie dem Neuroblastom sind Immuntherapien ein wichtiger Bestandteil und werden in Zukunft noch weiter an Bedeutung gewinnen. In unserer Arbeit konnten wir einen Einfluss der KIR Rezeptor - HLA Klasse I Interaktion auf die NK-vermittelte Lyse zeigen, jedoch spielt die Expression der aktivierenden Liganden sowie die ADCC durch den therapeutischen GD2-Antikörper ch14.18 eine größere Rolle für die Bekämpfung der Tumorzellen. Darüber hinaus scheinen spenderspezifische Unterschiede die wichtigste Determinante der NK-Aktivität zu sein, d.h. ein „guter“ Spender wird, unabhängig von einem eventuell vorhanden KIR RL Mismatch, eine gesteigerte Lyse verglichen mit einem „schlechten“ Spender zeigen. Ebenso besitzen γδT-Zellen, wenn auch in geringerem Maße als NK-Zellen, die Fähigkeit zur ADCC und sind somit im Zusammenspiel mit letzteren potente Effektoren in der Bekämpfung von Tumorzellen.
Das Ziel unserer Forschungsarbeit ist die Weiterentwicklung der bestehenden Immuntherapien für das Neuroblastom, um damit das Überleben zu verlängern und therapiebedingte Nebenwirkungen zu reduzieren.
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