Dissertation ist gesperrt bis 07. Dezember 2022 !
Lipide haben unterschiedliche Funktionen in biologischen Zellen, z.B. Membranaufbau, Energiespeicherung und Signalübertragung. Eine charakteristische Klasse von Lipiden, die für die bioaktive Signalübertragung wichtig ist, besteht aus Oxylipinen. Oxylipine werden durch Oxidation von Fettsäuren gebildet, die ihrerseits durch die enzymatische Aktivität von Phospholipasen aus komplexen Lipiden freigesetzt werden können. Lipide, einschließlich der Oxylipine, spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten. Forscher interessieren sich nun für das Lipidom in Thrombozyten und für dessen Änderung während ihrer Aktivierung und wollen so die an diesem Prozess beteiligten biochemischen Wege kennenlernen, um schließlich neue therapeutische Ansätze gegen Krankheiten zu finden, an denen Thrombozyten beteiligt sind. Die letzten Jahrzehnte haben beispiellose technologische Innovationen in der analytischen Chemie gebracht, wie in der Chromatographie (z.B. hocheffiziente sub-2-µm-Partikel für stationäre Phasen, Kapillarsäulen für die Flüssigkeitschromatographie (LC), neuartige chirale Materialien) oder in der Massenspektrometrie (MS) (z.B. Massenspektrometer mit erhöhter Auflösung oder erhöhter Empfindlichkeit, neuartige Analysestrategien wie nicht-zielgerichtetes Profiling mittels so genannter “sequential window acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra” (SWATH)-Datenerfassung). Diese Neuerungen haben das exponentielle Wachstum in den verschiedenen „Omics“ -Wissenschaften, wie auch in der Lipidomik vorangetrieben. In meinem ersten Projekt wurde eine kombinierte zielgerichtete LC-MS/MS-Methode zur Analyse von Oxylipinen und Fettsäuren entwickelt, und in Zellüberständen von Thrombozyten angewendet. Die MS-Daten wurden mit der SWATH- Datenerfassung erfasst und die Methode dahingehend optimiert, eine breite Abdeckung der Analyten sicherzustellen und die erforderliche Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen für die 3 Zielverbindungen, Thromboxan B2 (TXB2), 12-Hydroxy-5Z,8E,10E-Heptadecatriensäure (HHT) und 12-Keto-5Z,8E,10E-Heptadecatriensäure (KHT), zu gewährleisten. Darüber hinaus wurde eine neue allgemeine Synthesemethode für Ketoanaloga von Hydroxyfettsäuren beschrieben. Die Studie ergab schließlich, dass aktivierte Blutplättchen hohe Mengen an TXB2, HHT und KHT freisetzen: durchschnittlich 13, 15 bzw. 0,6 attomol pro Blutplättchen. Darüber hinaus zeigte eine nicht-zielgerichtete Analyse einen signifikanten Anstieg anderer Oxylipine und mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA), die bei der Aktivierung freigesetzt werden. Über dieses Phänomen ist bisher wenig bekannt und seine biologische Bedeutung ist noch nicht vollständig geklärt. Meine zweite Studie befasste sich mit der Entwicklung einer neuen LC-Methode zur Oxylipin-Trennung mit einer Kapillarsäule (Innendurchmesser gleich 0,5 mm). Ein so genanntes „scheduled selected reaction monitoring“ (SRM-MS/MS) lieferte hohe Empfindlichkeit, Genauigkeit und Präzision für die Quantifizierung von 42 Oxylipinen. 13 interne Standards wurden über die LC-Trennung verteilt und zur Normalisierung der Analyten verwendet. Darüber hinaus wurden verschiedene Extraktionsprotokolle und Kalibrierungsmethoden verglichen. Die optimierte Methode verwendet Bond Elut Certify II-Kartuschen (mit Mixed-Mode reversed-phase/Anionenaustauscher Material) zur Festphasenextraktion und externe matrix-matched Kalibranten. Die Methode wurde mit konzentriertem Plasma validiert, das eine leicht verfügbare, wenngleich herausfordernde biologische Matrix war. Es konnten somit 19 Oxylipine in nicht-aktivierten Blutplättchen nachgewiesen werden. Die dritte, von mir entwickelte Analysemethode verwendete eine moderne chirale LC-Säule zur Enantiomerentrennung von Oxylipinen. Das Verfahren zeigte eine hervorragende Peakauflösung und eine hohe Empfindlichkeit, die durch die SRM-MS/MS-Detektion bereitgestellt wurden. Neunzehn Enantiomerenpaare und ein Diastereomerenpaar von Hydroxyfettsäuren wurden in an der Luft autoxidierten PUFA und in Zellüberständen von Thrombozyten quantifiziert. Die autoxidierten Proben enthielten erwartungsgemäß racemische Gemische, wohingegen die einzelnen Enantiomere meist in den Thrombozytenproben nachgewiesen wurden. Dabei war die 12(S)-Hydroxyeicosatetraensäure (12(S)-HETE) das höchst abundante Oxylipin in den Thrombin-aktivierten Proben. Weitere interessante Beobachtungen wurden über die 12-Hydroxyeicosatriensäure (12-HETrE) gemacht, die offenbar über 2 verschiedene enzymatische Reaktionen in Blutplättchen synthetisiert werden kann. Parallel zu den oben beschriebenen, gezielten Methoden wurden Thrombozytengruppen mit einer Umkehrphasen-LC-MS/MS-Methode für die allgemeine nicht-zielgerichtete Lipidanalyse analysiert. Die Sets enthielten Thrombozyten, die in vitro mit einem selektiven CXCR7-Rezeptoragonisten behandelt wurden, neben Kontrollen ohne diesem Agonist, Gruppen mit Plättchen die durch Thrombin aktiviert wurden sowie mit Thrombin und CXCR7 Agonist, und die nicht-zielgerichtete SWATH-Datenerfassung wurde für das Lipid Profiling verwendet. Darüber hinaus wurde ein neuartiger Ansatz für die Datenverarbeitung nach der SWATH Datenerfassung entwickelt, der ein verbessertes Peak-Picking, eine Lipididentifikation und Lipidquantifizierung umfasst und eine höhere Spezifität als herkömmliche Methoden bietet. Die Lipididentifikation wurde durch ein charakteristisches Elutionsmuster in Umkehrphasen-LC unterstützt, und die Quantifizierung erfolgte hauptsächlich unter Verwendung extrahierter Ionenchromatogramme (EIC) von Fragmenten aus SWATH. Die Endergebnisse der Thrombozytenlipidomen zeigten, dass Änderungen, die für die Thrombozytenaktivierung typisch sind (z.B. Erhöhung der Konzentration von Oxylipin und Lysophosphatidylinositol), nach Zugabe des CXCR7-Agonisten, stark unterdrückt waren. Dies bedeutet, dass der Agonist die Thrombozytenaktivierung reduzieren kann. Andererseits beeinflusste der Agonist selbst auch das Thrombozytenlipidom, da er im Vergleich zu ruhenden Thrombozyten einen erhöhten Acylcarnitinspiegel und eine Abnahme der Diglyceride aufwies.