Tumor suppressor p16INK4a and its potential regulator JunB in cytokine-induced senescence

Abstract

In dieser Arbeit wurde der Einfluss der zytokininduzierten Seneszenz (CIS) auf die genetische Integrität untersucht und wie die Signalübertragung der CIS auf molekularer Ebene erfolgt. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die Einleitung der CIS zu Veränderungen in den Chromosomenaberrationen führt, welche die Malignität der Tumorzellen verstärken könnte. Dazu wurden verschiedene murine RT2 und RT2xStat1-/- Krebszelllinien mit den Th1 Zytokinen (IFNγ und TNF) behandelt und untersucht, ob die Chromosomenaberrationen der Tumorzelllinien durch diese Behandlung verändert werden. Zu diesem Zweck wurde das genetische Material der Zellen vor Beginn des Experiments und nach 96 h Behandlung mit Medium oder Th1 Zytokinen unter Verwendung der CGH untersucht. Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass es sich bei den primären RT2 Krebszelllinien um eine heterogene Population handelt. Wenn zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits ein Gleichgewicht zwischen den Subpopulationen vorliegt, führt eine Th1-Zytokinbehandlung nicht zu einer Veränderung der Chromosomenaberrationen. Dies gilt sowohl für RT2 als auch für RT2xStat1-/- Krebszelllinien. Wenn das Gleichgewicht zum Zeitpunkt des Experiments jedoch noch nicht hergestellt ist, können nach der CIS Induktion Veränderungen der Chromosomenaberrationen auftreten. Dies führte zu einer spezifischen Selektion von einer Chromosom 4 bzw. Cdkn2a deletierten Subpopulation der RT2 Krebszelllinie 3. Ein in vivo Transfer dieser Zelllinie (nachfolgend als mSc bezeichnet) mit anschließender Immuncheckpointtherapie (ICB) zeigte, dass das Wachstum dieser Zellen nicht mehr durch die ICB gestoppt werden konnte. Eine nachfolgende CGH Analyse der verschiedenen mSc ergab, dass die Zellen einen punktuellen Verlust des Cdkn2a Genes aufweisen. Eine anschließende in vitro Th1-Zytokinbehandlung bewies, dass die Zellen nicht mehr auf die CIS ansprechen konnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit den Th1 Zytokinen die Selektion von Chromosomenaberrationen innerhalb einer heterogenen Zellpopulation beeinflussen kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Fehlen von Cdkn2a die Induktion von CIS verhindert. Die Induktion der CIS ist als mögliche Behandlungsoption für unzugängliche oder metastasierte Krebsarten besonders interessant, weil sie zu einem p16INK4a-abhängigen Wachstumsstopp fuhrt. Da TNF aufgrund seiner zytotoxischen Wirkung nicht systemisch verabreicht werden kann, ist die Identifizierung des Signalweges entscheidend, um eine TNF-unabhängige Aktivierung des TNF-Signalweges zu induzieren. Deshalb wurde untersucht, wie die p16INK4a Expression nach IFNγ- und TNF-Stimulation eingeleitet wird. Ein möglicher Kandidat für die Signaltransduktion ist der AP-1 Transkriptionsfaktor JunB. Wie in den Experimenten gezeigt wurde, wird die JunB Expression in der CIS induziert. Diese JunB Expression ist TNF abhängig. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die TNF-abhängige Induktion von JunB durch NF-κB vermittelt wird. Es wurden verschiedene Techniken zur Herunterregulierung bzw. zum knockout von JunB eingesetzt. Dies wurde, so die Hypothese, zu einer reduzierten p16INK4a Expression führen, welche die Induktion von CIS verhindert. Trotz einer reduzierten JunB Expression konnte in keinem der Ansätze die Einleitung der CIS verhindern werden. Es bleibt unklar, ob die verbleibende Menge an JunB ausreicht, um eine p16INK4a Expression zu induzieren, oder ob andere Transkriptionsfaktoren an der p16INK4a Induktion in der CIS beteiligt sind.

In this work, the effect of cytokine-induced senescence (CIS) on genetic integrity and the way signal transduction of CIS occurs at the molecular level was studied. In the first part, the question was addressed whether the initiation of CIS leads to changes in chromosomal aberrations which might increase the malignancy of tumor cells. Therefore, different murine RIP1-Tag2 (RT2) and RIP1-Tag2 x signal transducer and activator of transcription 1-/- (RT2xStat1-/-) cancer cell lines were treated with the CD4+ T-helper cell 1 (Th1) cytokines interferon gamma (IFNγ) and tumor necrosis factor (TNF) and it was investigated whether the chromosomal aberrations of the tumor cell lines were changed by this treatment. For this purpose, the genetic material of these cells was examined before starting the experiment, and after 96 h treatment with medium or Th1 cytokines using array comparative genomic hybridization (CGH). The results of the experiments show that primary RT2 cancer cell lines are a heterogeneous population. If an equilibrium between the subpopulations has already been established at the time of the investigation, Th1 cytokine treatment does not alter chromosomal aberrations. This applies to both RT2 and RT2xStat1-/- cancer cell lines. However, if the equilibrium has not been established at the time of the experiment, changes in chromosomal aberrations may occur after CIS induction. This phenomenon appeared in RT2 cancer cell line 3, which resulted in a specific selection of chromosome 4 and, respectively, cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Cdkn2a) loss subpopulation. An in vivo transfer of this cell line (referred to as mouse subcutaneous cell line (mSc)) with subsequent immune checkpoint blockade (ICB) treatment showed that these cells can no longer respond to ICB. A subsequent CGH analysis of the different mSc revealed that the cells have a selective Cdkn2a loss. A subsequent in vitro Th1 cytokine treatment proved that the cells could no longer respond to CIS. In summary, it was demonstrated that the treatment with the Th1 cytokines could alter the selection of chromosomal aberrations within a heterogeneous cell population. Moreover, it was shown that the absence of Cdkn2a prevents CIS induction. The induction of CIS is particularly interesting as a potential treatment option for inaccessible or metastasized cancers, as it leads to cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16INK4a)-dependent growth arrest. Since TNF cannot be administered systemically due to its cytotoxic effect, identification of the signaling pathway is crucial to induce TNF-independent activation of the TNF signaling pathway. Therefore, it was investigated how p16INK4a expression is induced after IFNγ and TNF stimulation. A possible candidate for signal transduction is the activator protein 1 (AP-1) transcription factor JunB proto-oncogene (JunB). As shown in the experiments, JunB expression is induced in CIS. This JunB expression is TNF-dependent. Further investigations showed that the TNF-dependent induction of JunB expression is mediated by nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB). Different techniques were used to downregulate or knockout JunB. According to the hypothesis, this would lead to a reduced p16INK4a expression, which prevents the induction of CIS. Despite a reduced JunB expression, none of the approaches could prevent the induction of CIS. It remains unclear whether the remaining quantity of JunB is sufficient to induce a p16INK4a expression or whether other transcription factors are involved in the p16INK4a induction.