Deletions and Functional Assessment of Exonic Variants affecting Splicing in Genes underlying Inherited Retinal Dystrophies

Abstract

Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Erforschung der molekularen Ätiologie bestimmter mendelscher Erkrankungen, die durch Netzhautfunktionsstörungen und Sehstörungen gekennzeichnet sind. Ich führte eine detaillierte Untersuchung von de novo Mutationsereignisse durch, die zu genomischen Deletionen oder zur Umwandlung in pathogene Haplotypen in Exon 3 von OPN1LW und OPN1MW führen und dadurch eine Blauzapfenmonochromasie verursachen. Der Fokus dieser Arbeit geht jedoch über die Identifizierung von genetischen Varianten hinaus und fokussiert sich auf die funktionale Charakterisierung putative pathogene (Splicing-) Varianten und der Etablierung einer robusten Genotyp-Phänotyp-Korrelation. Der Schwerpunkt der Untersuchungen galt der Wirkung exonische Varianten auf die Transkriptprozessierung, namentlich auf die Retention bzw. das Skipping des betroffenen Exons. So induziert die exonische Variante c.1684C>T/p.Arg562Trp im murinen Pde6a-Gen ein In-Frame-Exon-Skipping in >60% der Transkripte in der Mäusenetzhaut. Die homologe Missense-Mutation bei RP-Patienten verursacht zudem eine verminderte enzymatische Aktivität der PDE6A auf Proteinebene. Vergleiche zwischen analogen Mutationen in Ortholog- und Paralog-Genen belegen den potenziellen Einfluss synonymer Varianten auf den Spleißprozess. In diesem Sinne habe ich retrospektiv den Effekt von seltenen Variantenkombinationen (d.h. Haplotypen) in Exon 3 von OPN1LW und OPN1MW bei Blauzapfenmonochromasie Patienten auf ihre Wirkung bzgl. Transkriptsplicing untersucht. In neun von zwölf untersuchten Haplotypen, die individuell mittels eines semi-quantitativen Minigene Spleiβ-Assay analysiert wurden, wurde ein Anteil von ≥20% anomal gespleißter Transkripte nachgewiesen. Um den Einfluß von Exon 3 Haplotypen auf das Splicing systematisch zu studieren, wurde in dieser Arbeit ein parallelisierte Minigen-Assay entwickelt und damit für mehr als 200 Haplotypen sowohl das Ausmaß des von jedem Haplotyp verursachten Spleißdefekts als auch den Gesamteffekt jeder exonischen Variante innerhalb des Haplotyps bestimmt. Die Varianten c.532A>G und c.538T>G in Exon 3 von OPN1LW/MW zeigten die größten Auswirkung auf die Exon-Retention. Mittels eines differentiellen RNA-Pulldown-Assays konnte der hnRNPF-Splicing-Faktor als möglicher Kandidat identifziert werden, der an Guanosin-Tripletts bindet, die durch die Varianten c.532A>G und c.538T>G gebildet werden.

The present dissertation comprises research about the molecular etiology of certain Mendelian disorders characterized by retinal malfunction and visual impairment. I performed a detailed investigation of de novo mutation events entailing genomic deletions or the conversion to pathogenic haplotypes in exon 3 of OPN1LW and OPN1MW underlying the occurrence of Blue Cone Monochromacy. Yet, the focus of this thesis goes beyond variant identification, including functional characterization to assess putative pathogenic variants and establish robust genotype-phenotype correlation. Exonic variants were assessed at the transcript level ‒ more precisely, attending to the splicing efficiency in terms of exon retention or exon skipping. Namely, the exonic variant c.1684C>T/p.Arg562Trp in Pde6a induces in-frame exon skipping in >60% of murine retinal transcripts. The homologous missense mutation in a human RP patient exerts a second pathomechanism at the protein level, reducing the enzymatic activity of PDE6A. Comparisons with analogous mutations in ortholog and paralog genes underscore the potential influence of synonymous variants in splicing. In this sense, other than single exonic variants, I retrospectively characterized the effect of haplotypes confined to exon 3 of OPN1LW and OPN1MW in Blue Cone Monochromacy patients on splicing efficiency. Nine out of twelve haplotypes individually assessed by a semi-quantitative minigene splicing assay resulted in a fraction of ≥20% of aberrantly spliced transcripts. To explore the full breadth of exon 3 haplotype induced splicing defects I developed a parallelized minigene assay leveraging the newest sequencing technologies to quantify for more than 200 haplotypes both the extent of splicing defect exerted by each haplotype and the overall effect of each exonic variant within the haplotype. These experiments showed that c.532A>G and c.538T>G in exon 3 of OPN1LW/MW are the two variants with the highest impact on exon retention during transcript splicing. An RNA-pulldown assay including the haplotype region identified the hnRNPF splicing factor as a putative candidate, which binds to guanosine triplets created by the variants c.532A>G and c.538T>G.