Entwicklung und Validierung von hochsensitiven Immunoassays zur Analyse von fünf inflammatorischen Biomarkern

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URI: http://hdl.handle.net/10900/110573
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1105736
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-51949
Dokumentart: Dissertation
Date: 2020-12-11
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Stevanović, Stefan (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2020-09-22
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
Keywords: Immunassay , Biomarker , Validierung , Entwicklung , Cytokine
Other Keywords: Simoa
Zytokine
Procalcitonin
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Proteinbiomarker sind ein wichtiger Bestandteil der Diagnose, Verlaufsbeurteilung und Risikoeinschätzung von Krankheiten in der Medizin, aber auch ein wichtiger Bestandteil der Forschung und der Arzneimittelentwicklung. Viele dieser Biomarker lassen sich mit herkömmlichen Immunoassays, aufgrund der fehlenden Sensitivität der Technologien, nicht quantifizieren. Dies schwächt die Aussagekraft und die Interpretation von Biomarkern und kann auch dazu führen das Biomarker nicht als solche eingesetzt werden können. Der Bedarf an Sensitivität führte zur Entwicklung von hochsensitiven Immunoassay-Plattformen wie der Single Molecule Array (Abk.: Simoa) -Technologie der Firma Quanterix. Diese nun erreichbaren Sensitivitäten haben das Potential neue diagnostische Biomarker zu identifizieren und zu etablieren. Simoa-Assays sind Mikrosphären basierte ELISAs, die aufgrund von extrem kleinen individuellen Reaktionsräumen gekoppelt mit einer Signalamplifikation den hoch sensitiven Nachweis von niedrigkonzentrierten Analyten ermöglichen. In dieser Arbeit wurden hochsensitive Simoa-Immunoassays für die Zytokine IFN-γ, IL-2, IL 10 und IL-17 und dem Entzündungsmarker PCT entwickelt, die eine hoch sensitive, präzise und einfache Quantifizierung dieser Analyten in Serum, Plasma oder CSF ermöglichen. Die entwickelten Simoa-Immunoassays sind semiautomatisierte Assays, die eine parallele Bearbeitung einer großen Probenanzahl ermöglichen. Im Anschluss an die Entwicklungsphase wurden die Immunoassays in einem zweckgerichteten Ansatz, unter Berücksichtigung der entsprechenden Richtlinien der Gesundheitsbehörden EMA und FDA, validiert. Anhand der ermittelten Validerungsparameter konnte aufgezeigt werden, dass die Sensitivitäten sehr gut und die dynamischen Bereiche passend sind. Die Anwendbarkeit der Assays zur Quantifizierung der Analyten in humanen Serum- und Plasmaproben gesunder Spender wurde in dieser Arbeit gezeigt und für vier der Analyten (ausgenommen IL-2) aufgrund der ausreichenden Sensitivität der Immunoassays ein Referenzbereich gesunder Spender ermittelt. Des Weiteren wurde mit dem entwickelten hochsensitiven PCT Simoa-Assay untersucht, ob die Bestimmung der PCT Konzentration bis in den niedrigen Konzentrationsbereich, die diagnostische Aussagekraft von PCT für die Differenzierung zwischen einer bakteriellen und einer viralen Meningitis steigern kann. Wäre diese Arbeitshypothese korrekt könnte PCT, anders als bisher beschrieben, auch als Biomarker für eine virale Meningitis in der Klinik eingesetzt werden und könnte eine schnellere Diagnose der zugrundeliegenden Ursache ermöglichen. Zur Untersuchung dieser Arbeitshypothese wurde zunächst ein Methodenvergleich zwischen dem entwickelten PCT Simoa-Assay und dem klinischen B·R·A·H·M·S PCT-Sensitive Kryptor-Assay durchgeführt. Es konnte eine gute Korrelation zwischen dem neu entwickelten PCT Assays und der in der Routinediagnostik oft angewendeten Methode zur Quantifizierung von PCT demonstriert werden. Die in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten die Arbeitshypothese jedoch nicht bestätigen. Mit dem entwickelten PCT Simoa-Assay konnte nicht zwischen gesunden Spendern und Patienten mit diagnostizierter viraler Meningitis diskriminiert werden, was PCT zu keinem Biomarker für eine virale Meningitis macht. Es konnte aber die in der Literatur beschriebene diagnostische Aussagekraft von Procalcitonin zur Diagnose einer bakteriellen Meningitis bestätigt werden. Zuletzt wurde untersucht, ob mit Hilfe der entwickelten hochsensitiven Immunoassays neue Biomarker als Indikatoren des Trainings- und Belastungsprozesses bei Sportlern ermittelt werden können. Die Ergebnisse zeigten, dass ein 30-minütiger Tempodauerlauf ausdauertrainierter Sportler im Bereich der aeroben-anaeroben Schwelle Einflüsse auf die Konzentration der Analyten IFN-γ, IL-10 und PCT im Serum der Probanden hat. Diese waren aber zum Teil geringer als in der Literatur beschrieben. Um zu untersuchen, ab welcher Belastung die untersuchten Analyten ggf. deutlich signifikanter ansteigen, müssten unterschiedliche Belastungsstärken, Belastungsdauern aber auch Erholungsphasen untersucht werden. Mit den neu entwickelten Simoa-Assays wurde gezeigt, dass Sensitivitäten bis in den niedrigen pg·mL-1-Konzentrationsbereich für die gewählten Proteinbiomarker erreicht werden können. Dies ermöglicht es bereits bestehende Aspekte, aber auch neue Fragestellungen zu untersuchen, und kann somit zu weiteren Erkenntnissen bei der Erforschung von inflammatorischen Prozessen führen

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