Inhaltszusammenfassung:
Das Sinnesorgan Auge ist ein wichtiger Bestandteil des menschlichen Lebens. Mit Hilfe des Augenlichtes können Menschen sich in ihrer Umgebung zurechtfinden, orientieren und mit dieser interagieren.
Da Erkrankungen wie zum Beispiel altersbedingte Makuladegenerationen oder genetisch bedingte Leber‘sche Kongenitale Amaurose Erkrankungen zu einem verfrühten Verlust des Augenlichtes führen können, benötigt die medizinische Forschung Möglichkeiten an Modellen dieser Erkrankungen zu forschen.
Retina Organoide sind ein relativ neuer und vielversprechender Ansatz, um an retinalen Erkrankungen zu forschen. Retina Organoide (RO) sind aus human induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierte gewebeähnliche Spheroide, die sich in vitro in ähnlicher Anordnung präsentieren wie in der Netzhaut in vivo. Sie besitzen unter anderem dieselben generellen Zelltypen wie die Retina und verfügen über eine ähnliche Schichtung.
Verschiedene Forschergruppen konnten zeigen, dass das Mikro-RNA (miRNA) Cluster 183/96/182 einen Einfluss auf die Entwicklung der Netzhaut besitzt. So wurde gezeigt, dass bei Mäusen der Verlust des miRNA Clusters 183/96/182 zu einem Untergang der Außensegmente (AS) von Photorezeptoren führt, während eine Überexpression in retinalen Organoiden aus Maus- induziert pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zu einer verbesserten Außensegmententwicklung führt.
Ziel meiner Arbeit war es, zu untersuchen, ob mithilfe der Überexpression des miRNA Clusters 183/96/182 die beschleunigte Reifung und Verbesserung der AS von Photorezeptoren auch bei aus humanen hiPS-Zellen differenzierte ROs erreicht werden kann.
Zu diesem Zweck wurden aus hiPS-Zellen generierte ROs an Tag 80 mit einem lentiviralen miRNA-Überexpressionskonstrukt transfiziert. Danach wurden sie mittels Immunfluoreszenzfärbungen, Elektronenmikroskopie und Calcium-Imaging analysiert.
Die analysierten ROs mit Überexpression zeigten keine Veränderung bei der Morphologie und der Anzahl der Photorezeptorbildung. Jedoch beeinflusste die Überexpression die Reifung der AS, die Lokalisation und Menge der Außensegmentproteine in den Immunfluoresenzfärbungen. Mittels Elektronenmikroskops konnten fortgeschrittene reife außensegmentartige Membrandisks ermittelt werden, während im Calcium Imaging eine erhöhte Anzahl von lichtaktiven Zellen detektiert wurde.
Um die Wirkung einer photorezeptorspezifischen Überexpression zu ermitteln, wurde das miRNA Cluster mithilfe eines photorezeptorspezifischen Genpromoters (IRBP) in retinalen Organoide eingebracht.
Hier zeigte sich eine deutliche Überexpression der messenger RNA-Konzentrationen der jeweiligen miRNAs. Ebenso zeigten die immunfluoreszenz- Färbungen der IRBP-miRNA-mCherry ROs eine gesteigerte Signalanzahl, sowie ein gesteigertes Signalintesität auf Höhe der AS.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass in dieser Studie das miRNA-Konstrukt insgesamt einen positiven Einfluss auf die Entwicklung der AS hat.
Die Arbeit könnte einen Teil dazu beizutragen, die RO-Modelle zu verbessern, sodass sie in Zukunft für Medikamententests, Krankheitsstudien und personalisierte Medizin verwendet werden können.
