Anreicherung der Side Population der KG-1a-Zelllinie unter Inkubation mit Doxorubicin und Disulfiram

Abstract

Nach deutlicher Verbesserung der Prognose in den letzten Jahrzehnten ist das OS der kindlichen AML bei 65-75% zuletzt nahezu stagniert. Begrenzt werden weitere Therapieerfolge u.a. durch eine therapieresistente Zellfraktion mit hämatopoetischen Stammzelleigenschaften (LSCs), welche als eine der Ursachen für Frührezidive der AML angesehen werden. LSCs befinden sich überwiegend in der Quieszenz, welche sie weniger anfällig für etabilierte Zytostatika machen. Als weiterer Resistenzmechanismus ist die Dichte an ABC-Transportern der Biomembran überexprimiert. Dies ermöglicht es ihnen Medikamentenkonzentrationen intrazellulär niedrig zu halten, indem sie Substrate aktiv aus der Zelle pumpen. Außerdem besitzen LSCs ausgeprägte antioxidative Schutzmechanismen, welche sie vor einem vorzeitigen Eintritt in proapoptotische Signalwege bewahren. Sowohl die Therapie von Frührezidiven als auch die Resistenzmechanismen führen zu erhöhten Gesamtdosen von Zytostatika wie Doxo (ein Anthrazyklin). Doxo ist aufgrund kardiotoxischer Langzeitnebenwirkungen nur dosislimitiert anzuwenden. Im Rahmen der Repositionierung von Medikamenten ist DSF mit antineoplastischen Nebeneffekten auffällig geworden. DSF wurde zuvor über 60 Jahre in der Entwöhnungsphase von Alkoholerkrankten mit geringem Nebenwirkungsprofil angewandt. DSF gelangt als Chelatbilder mit Metallionen wie Cu selektiv vermehrt in Zellen von Malignomen. Intrazellulär wirkt DSF in-vitro über den NPL4-p97-Signalweg proteotoxisch, erhöht die ROS-Level der Zelle, indem es Nrf2 und NF-kB hemmt, und bewirkt zusätzlich in in-vivo-Modellen eine ALDH-Hemmung. In zahlreichen Studien an Tumoren unterschiedlichster Entität wirkte DSF sowohl an der Hauptpopulation als auch den Zellen mit Stammzelleigenschaften zytotoxisch. Unsere Arbeit untersucht den Einfluss von DSF in Kombination mit Doxo nach Inkubation (72h mit einmaliger und 120h Inkubation mit zweimaliger Medikamentengabe) auf KG-1a-Zellen in Bezug auf Proliferations-, Zytotoxizitäts- und Zellzyklusverhalten und der Veränderung der Hoechst-SP. Die Hoechst-SP von KG-1a-Zellen ist die zytometrische Darstellung einer Subpopulation mit hohem Anteil CD34+/CD38--LSCs nach Färbung mit dem Farbstoff Hoechst-33342. Diese präsentieren sich durch den Efflux des Hoechst-Farbstoffes aus den leukämischen Vorläuferzellen als bogenförmiger Schweif angrenzend an die Hauptpopulationen. Die Ergebnisse unserer Arbeit zeigen, dass DSF/Doxo-Kombinationen synergistische Effekte an KG-1a-Zellen erzielen. Anders als in vergleichbaren Arbeiten können wir den Benefit einer Kombinationsanwendung erst in höheren DSF-Konzentrationen (5/2µM und 5µM) und häufig erst nach zweimaliger Medikamentengabe nachweisen. Wir erklären dies durch den alleinigen ROS-abhängigen schädigenden Effekt, welcher erst in hohen DSF-Konzentrationen eintritt. Hier weisen wir einen zusätzlichen Nutzen bzgl. des proliferations- und zytotoxischen Verhaltens im Vergleich zur Doxo-Monoanwendung mit 1/2µM-Doxo nach. Bezogen auf die Zellzyklusverteilung findet eine DSF-dosisabhängige Reduktion der G0/G1- und S-Zellzahl sowohl im KZV als auch LZV statt. Ebenfalls kann die Beobachtung eines verzögerten Zellübertritts aus der G0/G1- und S-Phase in die G2/M-Phase beobachtet werden. Dieser wird zuvor im Sinne einer DSF-abhängigen Hemmung von DNA-syntheseregulierenden Enzymen beschrieben. In hohen DSF-Konzentrationen (ab 5/2µM DSF) liegen im LZV die Zellzahlen aller Populationen unterhalb der alleinigen Doxo-Anwendung. Weiterhin zeigen wir, dass bei zweizeitiger Gabe die Kombinationsanwendung den Anteil unreifer diploider SP (strikt gegatete naive Vorläuferzellen mit Stammzelleigenschaften) zusätzlich zur alleinigen Doxo-Anwendung senkt. In den höchsten DSF-Konzentrationen fallen die Werte nach 120h Inkubation unter die Werte der Leerkontrolle, sodass keine Anreicherung, sondern eine tatsächliche Reduktion der unreifen diploiden SP vorliegt. Für die unreife tetraploide SP findet hingegen keine Reduktion, sondern in allen DSF/Doxo-Kombinationsproben eine gesteigerte Anreicherung statt. In vielen Studien konnte kürzlich eine Cu-abhängige Erhöhung der DSF-Zytotoxizität nachgewiesen werden. Diese Veröffentlichungen in Zusammenschau mit unseren Ergebnissen ermutigen dazu, den Effekt von DSF/Cu in Kombination mit Doxo an KG-1a-Zellen sowohl an in-vitro- als auch in-vivo-Modellen zu erweitern. Sie sind vielversprechend bzgl. einer deutlichen DSF- und Doxo-Dosiseinsparung bei paralleler Erhöhung der Zytotoxizität und Reduktion der SP-Fraktion. DSF/Cu in Kombination mit Doxo hat das Potenzial durch erhöhte Reduktion der SP-Fraktion von AML-Zelllinien die Rate an Frührezidiven bei paralleler Doxo-Dosiseinsparung zu senken. Dies würde eine bessere Prognose der kindlichen AML bedeuten und die Langzeitnebenwirkung sowie die Lebensqualität AML-Überlebender wesentlich verbessern.