Einfluss von TGF-β auf oxidative Stressreaktionen in menschlichen Osteoblasten

Abstract

Wie aus zahlreichen Literaturquellen bekannt, beschränken sich die ROS-Funktionen nicht nur darauf Zellen zu schädigen, sondern wirken auch als Signalmoleküle bei einer Vielzahl reversibler regulatorischer Prozesse in nahezu allen Zellen und Geweben, einschließlich der Genexpression, sowie der Regulation des Zelltods und -wachstums, der Synthese von Biomolekülen und der Regulierung des Membranpotentials. Es ist derzeitig nicht klar, welche Mengen von ROS für den menschlichen Körper therapeutisch vorteilhaft sind. Einer der bekanntesten Wachstumsfaktoren, welcher die Entwicklung von oxidativem Stress in einer großen Anzahl von Zelltypen beeinflusst, ist der transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Rolle und den Mechanismus der Wirkung von oxidativem Stress auf durch TGF-β1 stimulierte menschliche primäre Osteoblasten zu bestimmen. Aus Spendergewebe (Spongiosa) isolierte Osteoblasten wurden mit 5 ng/ml rekombinantem humanem TGF-β1 (rhTGF-β1) stimuliert. Änderungen in der Genexpression, die mit oxidativem Stress assoziiert sind, wurden unter Gebrauch von human RT² Profiler PCR Array Oxidative Stress Plus bestimmt und die unter Anwendung der semi-quantitativen RT-PCR erhaltenen Ergebnisse verifiziert. Zusammenfassend zeigten mit rhTGF-β1 stimulierte primäre humane Osteoblasten eine signifikante Induktion der Expression von NOX4. Diese Tatsache wurde auch auf Proteinebene gestützt. Als Ergebnis führte die NOX4-Expression zur Anhäufung reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), was durch den DCFH-DA Assay bestätigt wurde. Um den Effekt von rhTGF-β1 auf die Migration und Proliferation von OB zu untersuchen, wurde ein sogenannter Scratch-Assay durchgeführt. Mit 5 ng/ml rhTGF-β1 stimulierte primäre humane Osteoblasten zeigten eine signifikant schnellere „Wundheilung“ als unstimmulierte Zellen. Die Veränderung von Proliferation und Migration von Zellen wurde weiter durch Western-Blot bestimmt. Auf Proteinebene zeigte sich die Proliferationsrate unwesentlich verändert in rhTGF-β1 stimulierten Osteoblasten. Im Gegensatz dazu wurde ein Anstieg des Vimentin-Spiegels, einem Marker für migrierende Zellen beobachtet. In Bestätigung des Obigen wurde auch eine Immunfluoreszenzfärbung mit Vimentin durchgeführt. Um die funktionale Rolle von NOX4-Aktivität in der Osteogenese separat zu bewerten, wurden die Zellen mit dem NOX4-Inhibitor Apocynin stimuliert. Die von uns ermittelten Daten lassen annehmen, dass die chemische Inhibierung von NOX4 keinen Einfluss auf die Proliferation, aber einen ungünstigen Einfluss auf die Migration hat. Zusammenfassend lassen sich die Ergebnisse also dahingehend interpretieren, dass die chemische Hemmung von NOX4 mit Apocynin die Migration von primären humanen Osteoblasten verlangsamt und stört. Bei Schäden an Organen und Geweben spielt die Zellmigration eine entscheidende Rolle bei Schutzvorgängen wie Wundheilung, Entzündung und Immunantwort. Somit erscheint die TGF-β1-induzierte NOX4-Expression eine entscheidende Rolle bei der Osteoblasten-Migration zu spielen, wodurch die Bedeutung von NOX komplexer wird und es als neues therapeutisches Ziel bei dem Prozess der Knochenregeneration betrachtet werden kann.