Metabolic engineering strategies for an increased PHB production in cyanobacteria

Abstract

Cyanobakterien repräsentieren einen der ältesten bakteriellen Phyla der Welt. Aufgrund ihrer globalen Verbreitung besitzen sie einen starken Einfluss auf globale Kohlenstoff- und Stickstoffkreisläufe. Trotz dieser großen Relevanz sind viele Aspekte ihres Metabolismus bislang schlecht erforscht. Ein Beispiel dafür ist Polyhydroxybutyrat (PHB), welches in vielen Cyanobakterien (auch dem Modelorganismus Synechocystis sp. PCC 6803) gebildet wird. Dieses intrazelluläre Polymer wird vornehmlich unter Stickstoffmangel synthetisiert, während Synechocystis in einen Überdauerungszustand namens Chlorose übergeht. Bislang sind die physiologische Relevanz von PHB sowie Einflussfaktoren auf dessen Biosynthese größtenteils unbekannt. In der vorliegenden Arbeit werden all diese Fragen adressiert und umfassend diskutiert. Um die physiologische Funktion des PHB zu erforschen wurde ein Synechocystis Wildtyp mit einer PHB-freien Mutante verglichen. Wir konnten zeigen, dass, im Gegensatz zu anderen Bakterien, PHB nicht als Kohlenstoffspeicher genutzt wird, und darüber hinaus keine Relevanz während der Recovery aus der Chlorose besitzt. Wichtige Faktoren für die PHB-Biosynthese sind sowohl die Beleuchtung als auch der Gasaustausch, wobei bei Tag/Nacht-Rhythmus (im Vergleich zu Dauerlicht), sowie bei hohem Gasaustausch mehr PHB gebildet wird. Interessanterweise wird PHB während der Recovery aus der Chlorose nicht abgebaut, sondern lediglich in kleinere Granula zerteilt und auf Tochterzellen verteilt. In anderen Organismen sind viele verschiedene Proteine am PHB-Metabolismus beteiligt, etwa während der Bildung, der Instandhaltung oder der Degradation der PHB Granula. In dieser Arbeit wurden mehrere Proteine untersucht, die einen Einfluss auf den PHB Stoffwechsel haben könnten. Dabei wurde ein neuer Regulator entdeckt, Slr0058, welcher die Anzahl und Größe von PHB-Granula beeinflusst. Bei der Untersuchung verschiedener Kohlenstoffwege stellte sich heraus, dass der Embden Meyerhof Parnas Weg der wichtigste für die PHB Bildung ist. Um den intrazellulären Ursprung des PHB zu ermitteln wurde verschiedene Knock-Out Mutanten untersucht, wie sich die PHB Biosynthese durch die Mutation ändert. Dabei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des Glykogen-Stoffwechsels sich negativ auf die PHB Bildung auswirkt, was auf eine Verknüpfung beider Polymere hindeutet. Dieser Stofffluss wird durch einen neu entdeckten Regulator, Slr0944, gesteuert. Dieser Regulator ist besonders abundant während der Chlorose, wo er die Phosphoglycerat-Mutase inhibiert und dadurch den Kohlenstofffluss reguliert. Aufgrund der ähnlichen Materialeigenschaften zu Polypropylen wird PHB häufig als eine biobasierte und biologisch abbaubare Alternative angesehen, was von großer biotechnologischer Relevanz ist. Die Eigenschaft einer Δsll0944 Mutante, während der Chlorose vermehrt Glykogen abzubauen, wurde genutzt, um einen PHB Überproduktionsstamm zu erzeugen. Dazu wurden in einem Δsll0944 Stamm PHB-Biosynthese-Gene überexprimiert, wodurch der höchste jemals gemessen PHB Gehalt in einem phototrophen Organismus erzeugt wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Verständnis vom PHB Metabolismus in Synechocystis und legen somit die Grundlage für eine nachhaltige, CO2-neutrale PHB Produktion.

Cyanobacteria constitute one of Earth’s oldest and most diverse bacterial phyla. Due to their expansion all around the globe they are strongly influencing global carbon and nitrogen cycles. Although cyanobacteria are so important for the maintenance of these global cycles, many aspects of their metabolism are still poorly understood. One example is the metabolism of polyhydroxybutyrate (PHB), which is produced in many cyanobacteria like the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. This intracellular biopolymer is mainly produced under conditions of nitrogen starvation when Synechocystis undergoes a transformation into a resting state termed chlorosis. However, the physiological function of PHB as well as corresponding factors influencing its biosynthesis are mostly unknown. In the present work, all these questions were investigated and comprehensively discussed. To investigate the physiological function of PHB, a Synechocystis wildtype was compared to a PHBfree mutant strain. We could show that in Synechocystis, unlike in other bacteria, PHB is not used as a carbon storage and is furthermore not required for resuscitation from chlorosis. Factors influencing the formation of PHB are the aeration as well as the illumination regime, with more PHB being formed during day/night rhythm (compared to continuous light) and with high gas exchange in the culture. Interestingly, we could show that PHB is not degraded after resuscitation but is instead only disaggregated to smaller granules and distributed among dividing cells. In other organisms, a variety of different proteins are involved in the PHB metabolism, including the formation, the maintenance as well as the degradation of the PHB granules. In this work we investigated several proteins, which are putatively involved in the PHB metabolism and discovered the novel regulator Slr0058, which is affecting the number and size of PHB granules. Different carbon pathways were analyzed for their impact on the PHB production, where the Embden Meyerhof Parnas pathway turned out to be the most important one. To analyze, where the carbon required for the formation of PHB is derived from, several knockout strains were analyzed for their ability to produce PHB. Whenever glycogen metabolism was disturbed, it negatively influenced the accumulation of PHB, indicating a direct link between both carbon-polymers. The carbon flux between both polymers was shown to be influenced by the protein Sll0944. This regulator is highly upregulated during chlorosis and inhibits the phosphoglycerate mutase, whereby it regulates the glycogen catabolism. Since PHB exhibits similar material properties to polypropylene, PHB is often considered as a biobased and biodegradable plastic substitute, which is of high biotechnological interest. The ability of a Δsll0944 mutant strain to rapidly degrade glycogen was exploited to create a PHB overproduction strain. To achieve this, PHB biosynthesis genes were overexpressed in a Δsll0944 background to create the strain PPT1, which produced the highest rates of PHB ever achieved in a phototrophic bacterium. The results generated in this work deepen the understanding of the PHB metabolism in Synechocystis and lay the foundation for a sustainable, carbon neutral production of PHB.