Role of Akt signaling in homologous recombination-dependent repair of radiation-induced DNA double strand breaks

Abstract

Nicht- oder falsch-reparierte Doppelstrangbrüche als Konsequenz einer Strahlen- bzw. Mutagenexposition können potentiell genotoxisch wirken und sich in Form von Chromosomenbrüchen und Chromosomentranslokationen im Genom manifestieren. Die wichtigsten Reparaturmechanismen für die Beseitigung von Doppelstrangbrüchen sind: die homologe Rekombination (HRR), das klassische nicht-homologe „end-joining“ (C-NHEJ) und das alternative nicht-homologe „end-joining“ (A-NHEJ). Das Funktionieren dieser drei Reparaturmechanismen ist essentiell für den Erhalt der genomischen Integrität der Zelle, spielt aber auch eine Rolle bei der Entstehung einer Strahlenresistenz in Tumorzellen. Der Proteinkinase B (Akt/PKB) Signalweg spielt bei der Regulation von Zellüberleben und Apoptose nach Bestrahlung eine wichtige Rolle. So beobachtet man bei verschiedenen menschlichen Tumorentitäten eine durch Tyrosinkinase-Rezeptoren oder durch Mutationen getriebene hyperaktivierte PI3K/Akt-Signaltransduktion. Funktionell agiert Akt/PKB als Serin/Threonin-Kinase und tritt in den Isoformen Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) und Akt3 (PKBγ) auf. Die Akt Kinaseaktivität spielt besonders bei der Regulation des Zellüberlebens von Tumorzellen eine Rolle. Besonders wichtig scheint dabei der Effekt auf die Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch das C-NHEJ zu sein. Dabei stimuliert die Akt1 die Kinaseaktivität der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PK) dem Schlüsselenzym des C-NHEJ. Aber auch für die HRR wird eine Beteiligung der Akt diskutiert. Aktuell widersprechen sich jedoch einige Daten und es besteht weiterer Forschungsbedarf in der Frage der Bedeutung der Akt. So ist es das Ziel der vorliegenden Arbeit die Rolle der verschiedenen Akt-Isoformen bei der Doppelstrangbruchreparatur durch die HRR näher zu beleuchten. Dazu wurden, mit Hilfe von spezifischen siRNAs temporär bzw. mit spezifischen shRNAs stabil die Expressionen der Akt-Isoformen in der kolorektalen Tumorzellinie HCT116 blockiert. Es zeigte sich, dass in CENP-F Antigen positiven Zellen (d.h. in Zellen in der S- bzw. G2-Zellzyklusphase, die HRR-kompetent sind) nach Blockade von Akt1 oder Akt2 die Menge an nicht reparierten Doppelstrangbrüchen (-H2AX Foci, 24 h 76 nach einer Bestrahlung mit 4 Gy) signifikant erhöht waren. Die Blockade des C-NHEJ durch Einsatz von DNA-PK Inhibitoren, bzw. die Blockade des A-NHEJ durch poly-(adenosine diphosphate-ribose)-polymerase (PARP)-Inhibitoren zeigte für Zellen mit Akt1- und insbesondere aber für Zellen mit Akt2 Blockade im Vergleich zu den parentalen Kontrollzellen mit Akt-Wildtyp, eine deutliche Erhöhung der nichtreparierten Doppelstrangbrüche. In Ergänzung dazu, wurden Immunfluoreszenzuntersuchungen durchgeführt, um den Einfluss von Akt auf die Regulation von RAD51, dem wichtigsten Protein bei der HRR, zu untersuchen. Untersuchungen zur Kerntranslokation von RAD51 und zur Foci-Bildung von RAD51 im Kern, zeigten, dass das Fehlen der Isoformen Akt1 und Akt2 mit einer deutlich geringeren nukleären Akkumulation von RAD51 nach einer Strahlenexposition assoziiert war. Diese Reduktion führte zu einer deutlichen Radiosensitivierung im Vergleich zu den Parentalzellen mit Wildtyp Akt. Es ist bekannt, dass eine Blockade der HR zur sogenannten “synthetic lethality” in Gegenwart von PARP-Inhibitoren führt. Um die Sensitivität von Akt-defizienten Zellen auf eine PARP Inhibition zu testen, wurde der PARP-Inhibitor Olaparib eingesetzt, der von der FDA für die Behandlung von BRACA defizientem Brustkrebs zugelassen ist. In Akt1-defizienten Zellen führte die PARP-Inhibition zu einer signifikanten Radiosensitivierung, in Akt2-defizienten Zellen führte die Behandlung mit Olaparib sogar zum kompletten Verlust der Klonbildungsfähigkeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass es in Akt1- und Akt2-defizienten Zellen zu einer starken Beeinträchtigung der HRR kommt, die die Zellen besonders sensitiv für eine Blockade der PARP und damit für eine Blockade des A-NHEJ macht. Zusammenfassend lässt sich das Resümee ziehen, dass die beiden Isoformen Akt1 und Akt2 wichtige regulatorische Funktionen haben beim Vorgang der HRR, ohne die es bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der DNA zu einer massiven Beeinträchtigung kommt.