Mapping of the cytotoxic T cell response against two human herpesviruses

Abstract

Das Humane Cytomegalievirus (HCMV) und das Epstein-Barr-Virus sind weitverbreitet in der Bevölkerung. Beide können schwere Erkrankungen auslösen, die vor allem in immunsupprimierten Infizierten lebensgefährlich werden können. Neben Standardtherapien werden seit geraumer Zeit T-Zell-basierte Immuntherapien wie der adoptive T-Zell-Transfer erfolgreich zur Behandlung eingesetzt. Voraussetzung dafür ist die möglichst umfangreiche Kenntnis der Virus-spezifischen T-Zell-Epitope. Die T-Zell-Epitope beider Viren waren bereits Gegenstand zahlreicher Studien. Dennoch weist die Epitopkartierung in beiden Fällen gewisse Lücken auf. Bei EBV gibt es eine eklatante Lücke bei HLA-A*01-restringierten Epitopen. Während für alle anderen häufigen HLA-Allotypen dominante Epitope bekannt und charakterisiert sind, ist kein einziges HLA-A*01-restringiertes Epitop beschrieben. Aufgrund der Größe von HCMV haben sich Studien bezüglich seiner Epitope dagegen meist auf bestimmte Antigene konzentriert, was ebenfalls eine umfassende Kartierung verhinderte. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, neue HCMV-spezifische und HLA-A*01-restringierte, EBV-spezifische T-Zell-Epitope zu identifizieren und zu charakterisieren. Im Falle von EBV wurde hierfür eine Epitopvorhersage durchgeführt, welche die potenziell HLA-A*01-bindenen Peptide im gesamten EBV-Proteom identifizieren sollte. Aus dieser Liste wurden 171 Peptide mittels IFNγ ELISpot Assays auf ihre Immunogenität hin untersucht und nachfolgend die HLA-Restriktion stark immunogener Peptide mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Von den untersuchten Peptiden waren 29 immunogen; sieben davon waren dominante Epitope. Für alle dominanten Epitope konnte die HLA-A*01-Restriktion bestätigt und reaktive CD8+ T-Zellen in gesunden Spendern identifiziert werden. Im Gegensatz dazu wurden im zweiten Projekt potenzielle HCMV-Epitope als HLA-Liganden aus mit Virusmutanten infizierten Zelllinien isoliert und danach mittels Massenspektrometrie sequenziert. Von den 181 Liganden konnten 50 (30%) als Epitope charakterisiert werden. Für alle 13 dominanten Epitope konnte nachfolgend die vorhergesagte HLA-Restriktion bestätigt werden. Die Infektion von zwei weiteren Zelllinien erlaubte die Isolation hunderter neuer Peptide, die einer Immunogenitätstestung unterzogen werden können. Da die HLA-Liganden aus über 100 verschiedenen Proteinen stammen, eignet sich diese Methode hervorragend für eine umfangreiche Analyse der Epitope über das gesamte Proteom hinweg. Für beide Viren konnten damit neue, stark immunogene Epitope identifiziert werden, die in Zukunft für Antigen-spezifische Immuntherapien Verwendung finden können.

Both human cytomegalovirus (HCMV) and Epstein-Barr virus (EBV) are widespread in the population. They can cause severe morbidity and mortality, especially in immunocompromised hosts. Apart from the standard treatment with antiviral drugs, T cell-based immune therapies such as adoptive T cell transfer have been successfully used in recent years. A prerequisite for this treatment is the comprehensive knowledge about virus-specific T cell epitopes. The T cell epitopes of both viruses have already been the subject of numerous studies. Nevertheless, the epitope mapping in both cases shows certain gaps. In EBV there is a striking gap in HLA-A*01-restricted epitopes. While dominant epitopes are known and characterized for all other common HLAs, not a single useful HLA-A*01-restricted epitope has been described. In contrast, due to the size of HCMV, studies on its epitopes have mostly focused on specific antigens, which also prevented comprehensive mapping. The aim of this work was therefore the identification and characterization of novel HCMV-specific and HLA-A*01-restricted, EBV-specific T cell epitopes. To this end, epitope prediction was performed to identify HLA-A*01-binding peptides throughout the entire EBV proteome. From this list of peptides, 171 peptides were evaluated for immunogenicity using IFNγ ELISpot assays. Subsequently, the HLA restriction of strongly immunogenic peptides was verified via flow cytometry. Of the tested peptides, 29 were immunogenic; seven of them were dominant epitopes. For all dominant epitopes the HLA-A*01 restriction was confirmed and reactive CD8+ T cells in healthy donors were identified. In the second project, candidate HCMV epitopes were isolated as HLA ligands from cell lines infected with HCMV mutants and then sequenced by mass spectrometry. Of the 181 ligands, 50 (30%) could be characterized as epitopes. For all 13 dominant epitopes the predicted HLA restriction could be confirmed. The infection of two further cell lines allowed the isolation of hundreds of new peptides, which can be subjected to immunogenicity testing. Since the HLA ligands originate from more than 100 different proteins, this method is ideally suited for an unbiased, comprehensive analysis of the epitopes throughout the entire proteome. In summary, novel, strongly immunogenic epitopes were identified for both viruses, which could be employed for vaccination and antigen-specific immunotherapy in the future.