Functional characterization of the immune receptor RLP32 and its ligand IF1

Abstract

Pflanzen besitzen Immunrezeptoren, sogenannte pattern recognition receptors (PRRs), über die molekulare Muster von Pathogenen erkannt werden (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)). Durch die Erkennung von Pathogenen werden in der Pflanze Abwehrmechanismen (PAMP triggered immunity (PTI)) induziert. Vor Beginn dieser Doktorarbeit wurde der Translationsinitiationsfaktor 1 (IF1) aus bakteriellem Extrakt aufgereinigt. IF1initiiert frühe Immunreaktionen in A. thaliana. Das Rezeptorprotein RLP32 wurde als möglicher IF1-Rezeptor in A. thaliana identifiziert. In dieser Arbeit konnte RLP32 als Rezeptor von IF1 durch biochemische und immunologische Analysen bestätigt werden. RLP32 ist nur in einigen Mitgliedern der Brassicaceae-Familie zu finden. Die Komplementation von IF1-insensitiven Pflanzen mit RLP32 verhalf den Pflanzen dazu auf IF1 zu reagieren. Ebenso konnte gezeigt werden, dass IF1 und RLP32 in planta direkt und spezifisch miteinander interagieren. Ko-Immunopräzipitationsexperimente zeigten, dass RLP32 konstitutiv mit der Adapterkinase SOBIR1 interagiert. Der RLP32/SOBIR1-Komplex interagiert IF1-abhängig mit dem Ko-Rezeptor BAK1/SERK3, so wie es bereits für andere PRR/ Ligandensysteme beschrieben wurde. IF1 konnte als Ligand von RLP32 bestätigt werden. IF1 ist in Proteobakterien konserviert. IF1 aus verschiedenen Proteobacteria wiesen ähnliche immunologische Aktivitäten auf. Die Analyse von Deletionskonstrukten ergab, dass fast das ganze IF1-Protein (oder dessen Tertiärstrukturfaltung) nötig sind, für dessen immunologische Aktivität ist. Kulturpflanzen, die zu den Solanaceae gehören, verfügen nicht über ein RLP32-Homolog. Sie sind anfällig gegenüber proteobakeriellen Pathogenen. Nachdem RLP32 stabil in N. benthamiana transformiert wurde, konnte eine Immunantwort durch IF1 induziert werden. N. benthamiana, die RLP32 exprimieren, zeigten eine erhöhte Resistenz nach Infektion mit dem Pseudomonas syringae hrcC- Mutanten-Stamm, was darauf schließen lässt, dass N. benthamiana Reaktionsfähigkeit auf pathogene Proteobakterien erlangte. IF1 konnte erfolgreich das Immunsystem in A. thaliana primen, was zu einer erhöhten Resistenz gegenüber P. syringae führte. Im Gegensatz dazu führte eine Vorbehandlung von rlp32-knock-out Mutanten mit IF1 nicht zu Resistenz gegenüber P. syringae. Die Entdeckung des neuen Rezeptor-Liganden-Paares RLP32/IF1 kann in modernen Züchtungsmethoden impliziert werden, um Kulturpflanzen zu entwickeln, die gegenüber proteobakteriellen Pathogenen resistent sind.

Plants can detect pathogens via pattern recognition receptors (PRRs) that bind pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), thereby inducing PAMP triggered immunity (PTI). Prior to this study, the translation initiation factor IF1 was purified from bacterial extract and was shown to trigger early immune responses in A. thaliana. The receptor-like protein RLP32 was identified as the putative pattern recognition receptor of IF1 in A. thaliana. In this study, RLP32 was confirmed as the IF1 receptor using a variety of biochemical and immunological analyses. RLP32 is only present in some members of the Brassicaceae family. Complementation of IF1-insensitive plants with the RLP32 conferred the plants with the ability to respond to IF1. IF1 and RLP32 were further shown to directly and specifically interact in planta. Co-immunoprecipitation experiments showed constitutive interaction of RLP32 with the adaptor kinase SOBIR1. The RLP32/SOBIR1 complex interacts with the coreceptor BAK1/SERK3 in an IF1 dependent manner, analogous to what is reported for other PRR/ligand systems. IF1 was confirmed to be the ligand of RLP32. IF1 is conserved among Proteobacteria. IF1 derived from different Proteobacteria showed similar immunogenic activity. Deletion construct analysis revealed that virtually the entire IF1 protein (or its tertiary structure fold) are required for its immunogenic activity. Solanaceous crops lack an RLP32-homolog and are susceptible towards many pathogenic Proteobacteria. After stable transformation of N. benthamiana with RLP32, immune responses are induced when elicited with IF1. N. benthamiana expressing RLP32 showed enhanced resistance after infection with the hrcC- mutant strain of Pseudomonas syringae, indicating that N. benthamiana gained responsiveness to pathogenic proteobacteria. IF1 successfully primed immunity in A. thaliana leading to an enhanced resistance to P. syringae. In contrast, pretreatment with IF1 did not protect rlp32 knock-out mutant genotypes. The discovery of the new receptor-ligand pair RLP32/IF1 can be implemented in modern breeding techniques in crop plants to potentially improve resistance against proteobacterial pathogens.