Entwicklung einer bioaktiven Beschichtung zum spezifischen Gen-Silencing pathogenetischer Prozesse nach intravaskulärer Stentimplantation

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen weisen die höchste Sterblichkeitsrate in der westlichen Welt auf. Zu ihnen gehören viele verschiedene Krankheiten, wie z.B. die koronare Herzkrankheit (KHK). Der Hauptauslöser für die Entwicklung dieser Erkrankungen ist die Atherosklerose. Sie ist ein fortschreitender, entzündlicher Prozess, bei dem eine Verengung der Arterien durch die Bildung von atherosklerotischen Plaques auftritt. Dadurch kann weniger Blut zum Herzen transportiert werden, was zu einer generellen Unterversorgung des Herzmuskels oder im schlimmsten Fall zu einem Myokardinfarkt führen kann. Um den natürlichen Blutfluss in dem verengten Abschnitt der Arterie wiederherzustellen, sind zwei interventionelle Therapieoptionen üblich: 1) die Koronararterien-Bypass-Operation (CABG) oder 2) die perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA). Während bei der CABG überwiegend autologe Venentransplantate verwendet werden, wird bei der PTCA ein Ballon für die Erweiterung der Arterie verwendet, mit der Option, einen Stent über den Katheter zu platzieren. Beim Einbringen der bisher üblichen Stents, wie Bare Metal Stents (BMS) oder Drug Eluting Stents (DES), kann das Endothel durch das Expandieren des Stents und durch dessen Drahtgeflecht geschädigt werden und es kann zu einer nachfolgenden Entzündungsreaktion und einem Wiederverschluss (Restenose) kommen. Mit den DES wird dieses Risiko minimiert, da sie antiproliferative oder immunsuppressive Wirkstoffe freisetzen. Jedoch birgt dieser Vorteil auch einen Nachteil, da die Wirkstoffe gleichzeitig das Wachstum von Endothelzellen hemmen und Patienten länger auf antithrombotische Medikamente angewiesen sind. Gegenwärtig gibt es viele verschiedene Ansätze zur Entwicklung von Stents der nächsten Generation, um unerwünschte Reaktionen wie die In-Stent-Restenose (ISR) und eine späte Stentthrombose zu verringern. Ein initialer Prozess während der Entwicklung der Atherosklerose und nach Verletzung des arteriellen Gewebes durch die Stent-Implantation ist die Rekrutierung von Leukozyten. Diese wird durch verschiedene zelluläre Adhäsionsmoleküle (CAMs) wie z. B. dem interzellulären Adhäsionsmolekül 1 (ICAM–1), welches im Bereich der Verletzung von Endothelzellen vermehrt gebildet wird, vermittelt. ICAM–1 gehört zur sogenannten Leukozytenadhäsionsmolekülkaskade. Wenn es möglich wäre die Bildung des ICAM–1 sowie die Bildung weiterer relevanter Proteine spezifisch durch siRNA zu hemmen, so könnte die initiale Leukozytenadhäsionsmolekülkaskade durchbrochen und die Restenosegefahr vermindert werden. Drei verschiedene Stent-Beschichtungssysteme zur substratvermittelten small interfering RNA (siRNA)-Freisetzung gegen ICAM–1 wurden in dieser Arbeit entwickelt. Als Basis für die Schichtsysteme dienten Lipoplexe aus Lipofectamine®2000 und spezifische sowie fluoreszenzmarkierte siRNA oder Polyplexe aus Poly(ethylenimin) (PEI) und siRNA. Als Biomaterialien für die Einbettung der Lipo- oder Polyplexe wurden Atelokollagen, verschiedene Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) Resomere oder Polyelektrolyt-Mehrschicht (PEM)-Schichtsysteme aus PEI und Hyaluronsäure (HA) verwendet. Die Aufnahme bzw. Transfektion von siRNA in Zellen der Zelllinie EA.hy926 konnte mit allen drei Stent-Beschichtungssystemen nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Schichtsysteme über eine Langzeitfreisetzung verfügen oder die siRNA über einen kurzen Zeitraum abgeben. Die langfristige Freisetzung von siRNA ist besonders interessant für die Stent-Therapie, da der Stent in der Arterie verbleibt, um ihn offen zu halten, und die Heilung eines verletzten Endothels bis zu drei Monate dauern kann. Die erwünschte Langzeitfreisetzung von Lipoplexen, die in die PLGA-Beschichtungen eingebettet waren, konnte vom ersten bis zum zwanzigsten Tag gezeigt werden. Die etablierte Atelokollagen-Beschichtung mit siICAM–1-Lipoplexen bewirkte eine signifikante Reduktion der ICAM–1-Expression bis zum achten Tag. In beiden Ansätzen wurde die spezifische Spaltung der ICAM–1 messenger RNA (mRNA) gezeigt und eine gute Zellviabilität und Hämokompatibilität der Beschichtungen nachgewiesen. Der PLGA-Mehrschichtaufbau eignet sich außerdem zur simultanen Kotransfektion der grün fluoreszierenden (eGFP)mRNA und siRNA. Die beiden substratvermittelten siRNA-Freisetzungssysteme mit Langzeitwirkung ebnen den Weg für neue therapeutische Stentbeschichtungen, um das ISR-Risiko nach der Stentimplantation zu reduzieren. Das PEM-System mit HA und Polyplexen zeigte eine schnelle Freisetzung von siRNA-Partikeln innerhalb der ersten Stunde. Eine signifikante Verringerung des ICAM–1 Proteins wurde nachgewiesen und die Zellviabilität war nicht signifikant reduziert. Somit liefert diese Entwicklung ein weiteres lokales Anwendungssystem, das in die PTCA integriert werden kann.