Functional and biochemical analysis of the Capsicum annuum resistance protein Bs3

Abstract

Das Bs3 Protein aus Paprika (Capsicum annuum) vermittelt Resistenz gegenüber pflanzenpathogenen Bakterien der Gattung Xanthomonas. Während einer Infektion nutzt Xanthomonas sogenannte Effektorproteine, um die biochemischen Prozesse innerhalb der Pflanze zum eigenen Vorteil zu verändern. Dagegen haben Pflanzen verschiedene Mechanismen entwickelt, die Effektorproteine direkt oder indirekt erkennen und eine Immunantwort auslösen. Die Bs3 Resistenzreaktion wird von dem Xanthomonas Effektor AvrBs3 ausgelöst, der spezifisch and ein Sequenzelement im Bs3 Promotor bindet und dadurch Transkription des Bs3 Gens induziert. Die daraufhin ausgelöste hypersensitive Reaktion (HR), ein schnelles und lokal begrenztes Zelltodereignis, verhindert die weitere Ausbreitung der Bakterien. Basierend auf Sequenzvergleichen wird Bs3 der Familie der Flavin-monooxygenasen (FMOs) zugeordnet. Innerhalb der FMOs besteht die größte Ähnlichkeit gegenüber YUCCA (YUC) Proteinen, die das Phytohormon Auxin produzieren und daher eine wichtige Rolle für Pflanzenwachstum und entwicklung spielen. Daher stellt sich die Frage, warum Bs3, trotz seiner auffallenden Ähnlichkeit zu YUCs, eine so andersartige Funktion in der Pflanze ausübt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden vergleichende Analysen zwischen YUC und Bs3 Aminosäuresequenzen durchgeführt, um mögliche Sequenzabschnitte zu identifizieren, die für die unterschiedliche Funktionen der homologen Proteine innerhalb der Zelle verantwortlich sein könnten. Durch funktionale Analyse von Einzelmutationsderivaten und chimären Proteinen konnten austauschbare Regionen in Bs3 und YUC identifiziert werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Bs3 Expression zur Anreicherung der zwei Metaboliten Salicylsäure und Pipecolinsäure führt, welche eine wichtige Rolle in der Regulation pflanzlicher Resistenzreaktionen spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Protokoll zur nativen Reinigung von Bs3 Protein aus E. coli Kulturen etabliert. Mit der daraus entstehenden Möglichkeit, biochemische Studien zur enzymatischen Funktion von Bs3 in vitro durchzuführen, konnte gezeigt werden, dass Bs3 nicht nur strukturell, sondern auch funktional eine FMO darstellt. Bs3 bindet den Kofaktor FAD und produziert H2O2 durch die Oxidation von NADPH. Zur Durchführung funktionaler Vergleiche wurde das Bs3 Derivat Bs3S211A erstellt, das zwar NADPH-Oxidaseaktivität besitzt, jedoch keinen Zelltod in Pflanzen auslöst. Anhand des Vergleichs von Bs3 mit Bs3S211A konnte gezeigt werden, dass diese NADPH-Oxidaseaktivität allein jedoch nicht ausreicht, um eine HR auszulösen. Zur weiteren Erforschung des Signalwegs der Bs3 Resistenzreaktion wurde daher mit Experimenten zur Identifizierung des Bs3 Substrats begonnen.

The pepper (Capsicum annuum) bacterial spot 3 (Bs3) protein confers resistance against bacteria of the genus Xanthomonas which are the causal agent of bacterial spot disease. During infection, Xanthomonas injects effector proteins into the plant cell to reprogram the host´s protein biosynthesis and to enhance virulence. In return, plants evolved mechanisms that sense bacterial components and activate an immune response. The Bs3 resistance reaction is induced by the Xanthomonas transcription activator like effector (TALE) AvrBs3, which binds to a specific sequence element within the Bs3 promoter. Activation of Bs3 subsequently triggers a fast and local cell death reaction known as the hypersensitive response (HR), which limits spread of the pathogen. Sequence-based comparisons revealed that Bs3 belongs to the family of flavin containing monooxygenases (FMOs) and has highest similarity to YUCCA (YUC) proteins, a family of enzymes which produce the major plant hormone auxin, thereby playing a critical role in growth and development. This raised the question of why Bs3 fulfils such a different function compared to YUCs, despite its striking similarity. In the first part of this work, the Bs3 and YUC amino acid (aa) sequences were compared with the aim to identify sections that could be responsible for the different function of the two proteins. We conducted mutant analyses and gene shuffling experiments and identified sequence elements that are exchangeable. Furthermore, we found that Bs3 expression does not increase auxin levels but correlates with accumulation of the immune associated metabolites salicylic acid (SA) and pipecolic acid (Pip). In the second part of this thesis, a protocol for Bs3 protein purification was established which enabled the biochemical characterization of Bs3 and in vitro enzyme assays. We validated that Bs3 indeed functions as FMO and found oxidation of NADPH as well as production of H2O2 in vitro and in vivo. The creation and analysis of the Bs3S211A mutant derivative, which functions as NADPH oxidase but does not trigger HR, clarified that oxidase function is not sufficient to trigger cell death. In order to identify the putative Bs3 substrate, metabolite experiments were started that will have to be pursued in the future.