Tick-borne pathogens in African cattle – novel molecular tools for diagnostics in epizootiology and the genetics of resistance

Abstract

Zecken-übertragene Pathogene gehören zu den schädlichsten Mikroorganismen, die für Verluste bei der Tierhaltung verantwortlich sind, mit einer erheblichen Bedrohung für die menschliche Bevölkerung. Ihr Nachweis mittels Blutausstrich oder Serologie erlaubt eher die Bestimmung einzelner Arten, während Ko-infektionen eher die Regel sind. Einschränkungen ergeben sich insbesondere in Laboren mit begrenzten Ressourcen und ohne nachhaltige Kapazität. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung von 4 Gruppen von TBPs in Nordkamerun (Ehrlichien, Rickettsien, Spirochäten und Piroplasmen), wobei sieben Erstnachweise von Krankheitserregern in Rinderpopulationen (Borrelia theileri, Theileria mutans, T. velifera, Anaplasma platys, Anaplasma sp. ‘Hadesa’) in Kamerun sind, einschließlich den weltweiten Erstnachweisen von Rickettsia felis und Ehrlichia canis im Rind. Bei mehr als 80% (1123/1260, 89.1%) der untersuchten infizierten Rinder wurden mindestens zwei der vier untersuchten Genusgruppen (903/1123, 80.4%) von Krankheitserregern nachgewiesen, was die Einschränkung konventioneller Methoden unterstreicht. Über die Plattform eines kommerziellen Biochip-Anbieters (Chipron® in Berlin) wurde ein neuartiges Chip-basiertes Diagnostik-Array entwickelt. Dieses PCR-basierte Tool ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung von fünf Erreger-Gattungen, einschließlich neuer Arten, im Blut mehrfach befallener Rinder. Deutlich mehr Krankheitserreger ließen sich so bei einer erhöhten Spezifität und Sensitivität nachweisen. Das LCD-Array kann problemlos in kleinen Veterinärlaboratorien in endemischen Ländern einschließlich Afrikas eingesetzt werden. Die häufigen Mischinfektionen mit je nach Region und Rinderrasse unterschiedlicher Zusammensetzung von Erregern werden zusätzlich von Umweltfaktoren beeinflusst (χ2, regression, p< 0,05). Unterschiedliche Reaktionen zwischen Individuen und Rassen aus derselben Umgebung motivierten den Test auf Heritabilität. Niedrige bis moderate (h_(obs.)^2=0.1 and h_(liab.)^2=0.6) Erbanlagen beobachtet, was eine genomische Grundlage für das Merkmal der Resistenz gegen Zecken-übertragene Pathogene darstellt. Dieses Ergebnis bestätigt die Möglichkeit einer Verbesserung der Resistenz durch Züchtung. Die genomweite Analyse erwies die quantitative Natur der Merkmale und verwies auf potentiell assoziierte genomische Regionen, von denen eine noch nicht in der Literatur beschrieben wurde. Erweiterte Analysen und eine größere Stichprobengröße wären nötig, um die Rinder Rassen besser zu charakterisieren (Feinkartierung von Lozi unter natürlicher Selektion und Allel-Fixierung).

Les agents pathogènes transmis par les tiques comptent parmi les micro-organismes les plus nocifs responsables des pertes et de la détérioration des élevages, avec une menace importante pour la population humaine. Leur détection par frottis sanguin ou sérologie est plus susceptible de permettre l'identification d'espèces individuelle, alors que les co-infections sont plus fréquentes. Les contraintes sont tangibles dans les laboratoires aux ressources limitées et aux capacités non-durables. La présente thèse fait état de l'identification de sept agents pathogènes décris pour la première fois dans le cheptel bovin du Cameroun (Borrelia theileri, Theileria mutans, T. velifera, Anaplasma platys, Anaplasma sp. ‘Hadesa’) y compris ceux identifiés pour la première fois dans l'hôte bovin (Rickettsia felis et Ehrlichia canis). Plus de 80% de (1123/1260, 89.1%) la population infectée étudiée était co-infectée par au moins deux groupes des genres (903/1123, 80.4%) des agents pathogènes étudiés, ce qui souligne les limites des méthodes d'identification d'un seul agent pathogène précédemment utilisées. Sur la base de ces contraintes, une nouvelle matrice de diagnostic a été mise au point, grâce à la plate-forme du fournisseur commercial de biochip Chipron® à Berlin, en Allemagne. L'outil (LCD-array) basé sur la PCR a permis l'identification simultanée d'échantillons co-infectés, y compris les nouvelles espèces. Il a également permis d'identifier un plus grand nombre de microorganismes en état de co-infection avec une spécificité et une sensibilité accrues. Cet outil peut facilement être utilisé dans des laboratoires vétérinaires à capacité réduite dans les pays endémiques d'Afrique et d’ailleurs. Il a été démontré que la co-infection ainsi que la combinaison de pathogènes responsables diffèrent selon les zones climatiques et les populations bovines, influencées par des facteurs environnementaux (χ2, régression). Des réponses différentes entre individus et espèces (p< 0.05) d'un même environnement ont motivé le test des valeurs d'héritabilité. Des héritabilités faibles à modérées ont été décelées (h_(obs.)^2=0.1 and h_(liab.)^2=0.6), impliquant un fondement génétique du caractère de résistance. Ce résultat confirme la possibilité d'amélioration des facultés d’adaptation du bétail par gestion du système de production animale. Les analyses génétiques ont révélé les portions du génome responsables des phénotypes variés. Des analyses approfondies sur un plus grand échantillon seront nécessaires pour une différenciation des populations par représentation précise des loci sous sélection naturelle.

Tick-borne pathogens are among the most harmful micro-organisms responsible for losses in animal husbandry, with a significant threat to the human population. Their detection by blood smear or serology is more likely to allow the identification of individual species, whereas co-infections are more common. Limitations arise especially in laboratories with limited resources and without sustainable capacities. The present thesis presents the identification of seven organisms in the cattle population from Cameroon for the first time (Borrelia theileri, Theileria mutans, T. velifera, Anaplasma platys, Anaplasma sp. ‘Hadesa’) including the first published reports of Rickettsia felis and Ehrlichia canis in cattle worldwide. More than 80% of the infected studied population (1123/1260, 89.1%) were found being co-infected with at least two of the four studied groups of genera (903/1123, 80.4%), highlighting the caveats of the predominating single pathogen identification approach. Based on those observed limitations, a novel chip-based diagnostic array was developed through the platform of the commercial biochip manufacturer Chipron® in Berlin, Germany. The PCR-based tool allowed the simultaneous identification of co-infected samples of five genera, including novel species. Moreover, the array allowed the identification of significantly more pathogens in co-infection with increased specificity and sensitivity compared to traditional Sanger sequencing. This LCD-array can be easily implemented in small veterinary laboratories in endemic countries of Africa and elsewhere. The co-infection status and pathogen combinations was proven to differ between climatic zones and cattle populations, and being influenced by environmental factors (χ2, regression). Different responses between individuals and breeds (p< 0.05) from the same environment motivated the test for heritability values. The observed low to moderate heritability based on genotyping dataset (h_(obs.)^2=0.1 and h_(liab.)^2=0.6) implied a genomic foundation of the trait of resistance to tick pathogens. More importantly, this result confirmed the possibility of improvement by breeding, which may be implemented as a control measure. The genome-wide analysis revealed the quantitative nature of the traits of resistance, exposing putative associated genomic regions with one of them not yet reported in the literature. Extended analyses and larger sample size will be advantageous for population differentiation and breed improvement through fine mapping of loci under natural selection and allele fixation related to resistance and susceptibility traits.