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DISKUSSION
Wachstum ist eine Grundeigenschaft von Pflanzen.
Wie ein Keimling sich streckt und sich je nach Umweltbedingungen
entwickelt, wurde und wird intensiv untersucht. Es zeigte sich,
daß diese Vorgänge sehr viel komplizierter sind als zunächst
angenommen. So sind beim Streckungswachstum des Hypokotyls auch
rhythmische Vorgänge beteiligt. Sie äußern sich
als Circumnutationen und als circadiane Modulationen der Wachstumsrate.
Wo und wie diese Vorgänge ablaufen, ist nicht besonders gut
bekannt.
SCHUSTER (1996) hat an Arabidopsis
thaliana und Cardaminopsis
arenosa solche Circumnutationen untersucht und beschrieben,
wie sie von Umweltfaktoren wie Licht und Temperatur abhängen.
Er hatte bereits darauf hingewiesen, dass mit Arabidopsis
Untersuchungen in großer Zahl auf sehr engem Raum durchgeführt
werden können. Mit seinem Aufnahmesystem konnte dies jedoch
nur von oben durchgeführt werden. Von der Seite ließen
sich nur wenige Pflanzen gleichzeitig aufnehmen. Mit Hilfe einer
Verfahreinheit kann dagegen auch eine größere Zahl von
Pflanzen gleichzeitig von der Seite registriert werden. Bei Aufnahme
von oben lassen sich Periodenlänge, Amplitude und Richtung
von Schwingungen bestimmen. Seitliche Registrierung liefert daneben
auch Informationen darüber, an welchen Stellen des Hypokotyls
die Schwingungen und das Wachstums stattfinden. Sie besitzen somit
einen wesentlich höheren Informationsgehalt.
Ein umgebauter Nadeldrucker wurde zunächst
verwendet, um eine oder zwei Kameras zu verfahren. Die Entwicklung
dieser Anlage stand im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. Versuche,
die mit der Anlage durchgeführt wurden, haben daher teilweise
nur exemplarischen Charakter. Möglichst viele verschiedene
Anwendungsmöglichkeiten der Anlage sollten erprobt werden und
können als Anregung für weitere, umfangreichere Versuchsserien
dienen.
Das tagesperiodische Wachstum der Hypokotyle
von Arabidopsis thaliana
und Cardaminopsis arenosa
wurde bei verschiedenen Lichtbedingungen registriert. Ein besonderes
Augenmerk galt dabei auch der Lokalisierung und dem Verlauf von
Circumnutation. Die phototrope Reaktion auf seitliche Blaulichtpulse
wurde untersucht und gefunden, dass die Stärke der Reaktion
tagesperiodisch moduliert ist. Es wurde ferner versucht herauszufinden,
ob die phototrope Reaktion auf Wachstum oder auf reversiblen Änderungen
beruht. Verschiedene Substanzen wurden in wässriger Lösung
an unterschiedlichen Stellen der Keimlinge appliziert und ihre Wirkung
auf Wachstum, Circumnutationen und Wachstumsrhythmik geprüft.
An welchen Segmenten des Hypokotyls die CN
entstehen und welche physiologischen Prozesse dafür verantwortlich
sind, lässt sich nur klären, wenn man sehr detaillierte
Aufnahmen des wachsenden Stängels macht. Das gleiche gilt für
die tagesperiodische Modulation des Streckens. Dazu wurde eine weitere
Anlage gebaut, die auf einer dreidimensionalen Verfahreinheit beruht.
Um die Funktion der Auswertesoftware zu prüfen,
wurden Simulationen mit Modellpflanzen durchgeführt. Das Simulationsmodell
diente auch dazu, verschiedene Hypothesen zu testen, wie Circumnutationen
zustande kommen.
4.1.1 Konstruktion der
Verfahreinheiten
Wachstumsvorgänge bei Pflanzen sind mehrfach
mit Bildanalyse-Verfahren untersucht worden. GORDON et
al. (1984) benutzten ein halbautomatisches System zur Registrierung
gravitrop stimulierter Helianthus-Keimlinge.
Die Daten wurden dabei auf Videobändern oder auf photografischem
Material archiviert. KRISTIE und JOLLIFFE (1985) verbanden Keimlinge
mechanisch mit einem Messfühler und konnten über die elektrischen
Signale die Längenänderungen der Hypokotyle messen. Der
Messfühler reagierte jedoch nur auf die abgeleiteten Längenänderungen,
die durch Wachstum und Circumnutationen hervorgerufen wurden. Es
war deshalb nicht möglich, Richtung und Chiralität von
Schwingungen zu erfassen. Mechanischer Stress kann zudem die Reaktion
von Pflanzen beeinflussen, sodass berührungsfreie Messverfahren
in jedem Fall zu bevorzugen sind. Die von SCHUSTER und ENGELMANN
(1990) beschriebene Anlage basierte auf einer Videokamera und einem
Atari Computer. Sie konnte nur reduzierte Bilddaten speichern, was
einen erheblichen Informationsverlust bedeutet. Mit den hier beschriebenen
Verfahreinheiten und Softwareprogrammen hingegen werden echte Bilder
gespeichert, die dann beliebig oft betrachtet und unterschiedlichen
Auswerteverfahren unterzogen werden können. Beide Systeme bieten
den Vorteil, voll automatisiert zu sein, sodass damit Aufnahmen
auch über längere Zeiträume ohne unverhältnismäßig
hohen Arbeitsaufwand möglich sind. Mit den neu entwickelten
Verfahreinheiten werden Stereobilder aufgenommen. Dadurch kann die
dreidimensionale Bewegung von Keimlingen analysiert werden, was
bei Aufnahmen mit nur einer Kamera nicht möglich ist. ANTONSEN
und JOHNSSON (1996) benutzten deshalb 2 Atarisysteme zur seitlichen
Registrierung, um die räumliche Bewegung der Organspitze von
Hypokotylen darzustellen. CARE et al. (1998) untersuchten Zelllängenänderungen
bei circumnutierenden Phaseolus-Keimlingen. Sie markierten dazu
Anfang und Ende von übereinander liegenden Epidermiszellen
mit Farbtröpfchen. Alle zehn Minuten wurden von der Seite Aufnahmen
mit einem Umkehrmikroskop angefertigt. Zuvor wurde das drehbar gelagerte
Mikroskop so ausgerichtet, dass sich die markierten Zellen genau
in der Bildebene befanden. Zusätzlich zu den seitlichen Aufnahmen
wurde die Bewegung des Keimlings mit Videoaufnahmen von oben verfolgt.
Ein Vorteil dieser Methode war es, Längenänderungen auf
zellulärer Ebene verfolgen zu können. Der Nachteil der
Methode besteht jedoch darin, dass sie nicht automatisierbar ist.
Für die dreidimensionale Verfahreinheit ist geplant, mit entsprechender
Optik ebenfalls sehr große Abbildungsmaßstäbe zu
realisieren. Dafür ist eine automatische Fokussierung nötig,
die mit Hilfe der Aufnahmedaten der beiden Videokameras realisiert
werden könnte.
Die Entwicklung der eindimensionalen Verfahreinheit
stellte eine technische Herausforderung mit zunächst ungewissem
Ausgang dar. Der Kameraträger mit den beiden Kameras hatte
ein wesentlich höheres Gewicht als der ursprüngliche Druckkopf
und es war zu befürchten, dass dadurch die Führungsschienen
rasch abgenutzt würden. Anfangs wurde deshalb erwogen, zusätzliche
Führungen anzubringen. Da die Werkstatt jedoch meist mit anderen
Aufgaben befasst war, musste darauf verzichtet werden. Wider Erwarten
konnten jedoch mit der Verfahreinheit mehr als 50 Versuche mit jeweils
4 bis 7 Tagen Dauer durchgeführt werden, ohne dass sich Abnützungserscheinungen
zeigten.
Die Präzision der Anlage war sehr gut.
Die einzelnen Pflanzen wurden so genau angefahren, dass sich der
horizontale und vertikale Versatz zeitlich aufeinander folgender
Bilder im Sub-Pixel-Bereich bewegte. Nur in sehr seltenen Fällen
kam es vor, dass beim Verfahren einzelne Schritte verloren gingen.
Da vor jedem scan neu kalibriert wurde, war von solchen Fehlern
immer nur ein einziger Durchgang betroffen.
Probleme bereiteten die Framegrabberkarten,
die manchmal nicht gut auf das Kamerasignal synchronisierten. Dies
führte zu "durchlaufenden" Bildern. Da stets eine
größere Anzahl von Bildern gemittelt wurden, führten
einzelne durchlaufende Bilder zu "Schatten" von Pflanzen
an willkürlichen Stellen des zusammengesetzten Bildes. Solche
Bilder ließen sich dann meist nicht auswerten. Außerdem
waren sie schlechter zu komprimieren, das "Zippen" dauerte
länger und die resultierenden Zeitverzögerungen führten
gelegentlich zum Ausfall ganzer scans. Die Probleme mit den Framegrabberkarten
nahmen mit der Zeit zu. Austausch der Karten gegen neue lieferte
bessere, aber nicht völlig befriedigende Ergebnisse.
Der Aufbau einer dreidimensionalen Verfahreinheit,
die auf einer CNC-Maschine basierte, ging zunächst problemlos
vonstatten. Da die Antriebselektronik komplett selbst gebaut wurde[1],
war jedoch ein erheblicher Zeitaufwand nötig. Probleme bereitete
allerdings der Antrieb der z-Achse: Durch das Gewicht der Kameras
und des Kameraträgers begann sich der Schrittmotor dieser Achse
im stromfreien Zustand zu drehen und die Einheit rutschte nach unten.
Verschiedene Verfahren wurden erwogen, um dieses Problem zu lösen,
unter anderem auch eine mechanische Lösung mit Gegengewichten
an Umlenkrollen. Über einen Ruhestrom, der den Schrittmotor
im letzten aktuellen Zustand festhielt, konnte dieses Problem letztlich
behoben werden. Es war zu befürchten, dass es beim Umschalten
der z-Achse von Fahrstrom auf Haltestrom dennoch zum kurzfristigen
Abrutschen kommen würde. Dies war jedoch nicht der Fall.
Die dreidimensionale Verfahreinheit konnte
erst kurz vor Ende der geplanten Bearbeitungszeit des Themas fertiggestellt
werden. Nur wenige Versuche konnten damit durchgeführt werden,
die im wesentlichen der Erprobung der Anlage dienten. An Software
zur Auswertung der zusammengesetzten Bilder wird noch gearbeitet.
Weitere Versuche mit der Anlage und Veröffentlichungen in Zusammenarbeit
mit anderen Arbeitsgruppen sind geplant.
Mit die größten Schwierigkeiten
bereitete es, dass die beiden einzigen brauchbaren Kameras, die
zur Verfügung standen, unterschiedliche Modelle mit unterschiedlich
großen CCD-Chips[2] waren. Daraus
ergaben sich unterschiedliche Abbildungsmaßstäbe. Um
sie auszugleichen, mussten an den Kameras verschieden lange Zwischenringe
angebracht werden, was wiederum unterschiedliche Objektabstände
erforderte. Dennoch konnten keine absolut identischen Abbildungsmaßstäbe
erreicht werden. Es war daher auch noch eine zusätzliche rechnerische
Anpassung erforderlich. Dafür musste die Anlage regelmäßig
und zeitaufwändig geeicht werden.
Ein Problem stellte die Luftfeuchtigkeit in
den Klimakammern dar. Es war nicht möglich, die Pflanzen innerhalb
einer geschlossenen Kunststoff- oder Glasküvette zu registrieren,
da an den Wänden Licht reflektierte. Aus institutsinternen
Gründen musste die Arbeitsgruppe mehrmals innerhalb des Gebäudes
und in andere Klimakammern umziehen. Die neuen Kammern hatten eine
besonders hohe Luftumwälzung, die sich nicht reduzieren ließ.
Besonders in der kalten Jahreszeit misslangen hier wegen der geringen
Luftfeuchtigkeit viele Versuche. Die Pflanzen stellten in der trockenen
Umgebungsluft ihr Wachstum ein oder vertrockneten. Erst gegen Ende
der Versuchsserien konnte eine Klimakammer genutzt werden, in der
sich die Luftfeuchtigkeit auf hohem Niveau halten ließ. Geringe
Schwankungen von Temperatur und Feuchte lassen sich bei Klimakammern
aufgrund von Regelvorgängen nie ganz vermeiden.
![](4_1/image002.gif)
![](4_1/image004.gif)
Abbildung 4-1:
Schwankungen von Temperatur
und Luftfeuchtigkeit in einer Klimakammer.
Die Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsschwankungen
in der Klimakammer hatten bei manchen Versuchen Auswirkungen auf
die Zeitverlaufsbilder. Bei den Wachstumsbildern war der Effekt
kaum zu erkennen. Bei den Krümmungsalgorithmen war er jedoch
manchmal sehr stark, insbesondere bei starker Vergrößerung.
![](4_1/image006.jpg)
Abbildung 4-2:
Zeitverlaufsbild (Krümmungsalgorithmus
7) von Cardaminopsis arenosa.
Die Pflanze war im schwachen Dauer-Weißlicht in der Klimakammer
registriert worden, deren Schwankungen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit
in Abbildung 4-1 dargestellt werden. Die Periodenlänge der
Störungen entspricht der Periodenlänge der Kammerschwankungen.
Im dargestellten Aufnahmezeitraum wuchs die Pflanze nicht.
Bei der Berechnung der Krümmung
wird zwei mal abgeleitet. Dies liefert sehr kleine Werte, die erst
bei hoher Verstärkung sichtbar gemacht werden können.
Auch ohne den Einfluss von Schwankungen der Kammertemperatur und
Feuchte waren die Zeitverlaufsbilder der Krümmung stark mit
Rauschen behaftet. Um brauchbare Ergebnisse zu erzielen, musste
über größere Bereiche des Stängels gemittelt
werden. Auch kleine Schwankungen im Eingangssignal werden durch
die Krümmungsalgorithmen anscheinend verstärkt.
4.1.2 "Natürliche
Markierungen", Stängelerkennung und Auswerteprogramme
Die von uns als "natürliche
Markierungen" bezeichneten Helligkeitsunterschiede auf den
Hypokotylen beruhen unter anderem auf Reflexionen an der Oberfläche.
Kleine, ebene oder gleichförmig gekrümmte Bereiche der
Kutikula reflektieren das Infrarotlicht der seitlichen Beleuchtung
zur Kamera oder in andere Richtungen. Schwankungen der Temperatur
und vermutlich insbesondere der Luftfeuchtigkeit ändern den
lokalen Reflexionswinkel. Bereits geringe Änderungen haben
einen starken Einfluss auf das Helligkeitsmuster des Hypokotyls.
Auch wenn sich die Pflanzen im Verlauf von Circumnutationen auf
die Kameras zu oder von ihnen weg neigen, ändern sich die Reflexionswinkel.
Das Schicksal der einzelnen Hypokotylbereiche,
die in den Zeitverlaufsbildern des Wachstums als unterschiedlich
gefärbte Linien erschienen, ließ sich in den Zeitverlaufsbildern
mit dem Auge recht gut verfolgen. Da die "natürlichen
Markierungen" jedoch teilweise durch Reflexionen zustande kommen,
die sich bei Bewegungen ändern, war es schwierig, einzelne
Punkte auf dem Hypokotyl über mehrere scans algorithmisch zu
korrelieren. Ein solches Korrelationsprogramm ("Wurm")
wurde entwickelt. Mit ihm konnte ein Punkt auf dem Hypokotyl am
Ende eines Zeitverlaufsbildes markiert werden und das Programm versuchte,
diesem Punkt die entsprechenden Punkte aus den davor liegenden scans
zuzuordnen. Leider gelang die Korrelation häufig nicht, was
dazu führte, dass der "Wurm" sich "verirrte".
Er lief dann nicht mehr entlang der gefärbten Linien, sondern
in andere Richtungen. Die algorithmische Korrelation einzelner Stellen
des Hypokotyls über die Zeit ist aber eine wichtige Voraussetzung,
um eine Reihe von Fragen zu beantworten. Mit einem solchen Programm
wäre es zum Beispiel möglich, lokale Wachstumsgeschwindigkeiten
des Hypokotyls an verschiedenen Stellen nicht nur grafisch, sondern
auch numerisch anzugeben. Indem man einen Punkt weit oben am Hypokotyl
korreliert, könnte man die Bewegung des Keimlings quasi bei
Betrachtung von oben darstellen. Das würde Informationen über
die Chiralität von Circumnutationen liefern. Wenn man Festpunkte
an gegenüber liegenden Seiten des oberen und unteren Hypokotyls
verfolgen könnte, wäre es vielleicht möglich, die
Längenänderungen der jeweiligen Stängelseite während
der Schwingungen aufzuzeichnen. Damit könnte die Frage geklärt
werden, ob es sich bei den Circumnutationen um reine Wachstumsbewegungen
handelt oder ob auch elastische Vorgänge an ihrer Entstehung
beteiligt sind.
Bei dem Stängelerkennungsprogramm,
das für die zweidimensionale Verfahreinheit entwickelt worden
war, basierte die Auswertung darauf, die Stängelmitte zu bestimmen.
Dieses Programm konnte nur feste Bildformate auswerten und war an
die Zeilen- und Spaltenzahl der Kameras angepasst. Für die
Auswertung der Bilder der dreidimensionalen Verfahreinheit, die
sich aus vielen Teilbildern zusammensetzen, wird derzeit ein neues
Auswerteprogramm entwickelt, das mit variablen Bildformaten arbeiten
kann. Es soll die Stängelkanten detektieren, was in Hinblick
auf elastische oder plastische Vorgänge beim Wachstum von Bedeutung
ist. Da die Pflanzen mit der dreidimensionalen Verfahreinheit abschnittsweise
aufgenommen werden, können Aufnahmen in wesentlich größerem
Maßstab angefertigt werden. Erste Versuche mit der neuen Auswertesoftware
und Aufnahmen mit größeren Abbildungsmaßstäben
zeigten, dass hier aufeinander folgende scans wesentlich besser
korrelieren als beim alten Verfahren. Es ist auch zu erwarten, dass
die größeren Aufnahmen weniger stark mit Rauschen behaftet
sein werden. Dadurch lassen sich die Krümmungen und Krümmungsänderungen
auf dem Hypokotyl deutlicher und präziser lokalisieren, auch
ohne über lange Stängelbereiche mitteln zu müssen.
Da die neue Auswertesoftware mit variablen
Bildgrößen arbeiten kann, lassen sich auch die Aufnahmen,
die mit der zweidimensionalen Verfahreinheit angefertigt wurden,
mit ihr nochmals auswerten. Vielleicht wird es möglich, mit
Hilfe der neuen Software bei manchen der alten Aufnahmen eine Korrelation
aufeinander folgender scans zu finden. Damit könnten nachträglich
zusätzliche Informationen gewonnen werden wie weiter oben bei
dem Korrelationsprogramm ("Wurm") beschrieben.
[1]
frei verdrahtet nach der Krähennesttechnik
[2] 1/2
und 1/3 CCD
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