2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Anzucht der Keimlinge

Für die Versuche wurden möglichst junge Keimlinge von Arabidopsis thaliana, Cardaminopsis arenosa (L.) Hayek und anderen Arten verwendet. Für einen Versuch sollten sich die Pflanzen in einem möglichst ähnlichen Entwicklungsstadium befinden. Dazu war es nötig, Pflänzchen aus einer größeren Anzahl auswählen und in die Messanlage übertragen zu können. Die Keimlinge wurden deshalb einzeln auf schwarzen Filterpapierscheibchen (Durchmesser 5 mm, mit Papierlocher ausgestanzt) angezogen. Diese wurden auf einer Unterlage aus befeuchtetem, schwarzem Filterpapier der gleichen Sorte ausgelegt, das sich auf dem Deckel eines transparenten Kunststoffkästchens [1] (75 mm B, 32 mm H, 75 mm T) befand (SCHUSTER 1996). Größere Kästchen wurden für Versuche mit längerer Zeitdauer verwendet (75 mm B, 70mm H, 75mm T). Über einen Docht aus gewöhnlichem Filterpapier, der durch einen Schlitz in das mit Leitungswasser gefüllte Kästchen ragte, wurde es feucht gehalten.

Mit einem feinen, befeuchteten Pinsel wurde jeweils ein Samen in die Mitte der Filterpapierscheibchen platziert. Ein weiteres Kunststoffkästchen wurde mit der Öffnung nach unten als Verdunstungsschutz über die Auflage gestellt. Verschiedene Papiersorten wurden auf ihre Eignung als Unterlage geprüft. Als optimal erwies sich aktivkohlehaltiges Filterpapier [2]. Durch seine Dicke besaß es eine gute Kapillarwirkung und versorgte somit die Keimlinge gleichmäßig mit Wasser. Dieses Papier enthielt keine potenziell phytotoxischen Farbstoffe. Schwarz gefärbte Papiersorten, die nach Herstellerangaben einen schwefelhaltigen Farbstoff enthalten, führten zu unregelmäßiger Keimung. Ihre geringe Dicke war ebenfalls ungünstig. Ein Nachteil des aktivkohlehaltigen Filterpapiers war, gelöste Substanzen, die über das Gießwasser appliziert werden sollten, zu absorbieren. Solche Versuche wurden deshalb nicht durchgeführt. Weißes Papier als Unterlage war aufgrund der Lichtreflexion von unten ungeeignet. Die Pflanzen wuchsen atypisch und krümmten sich teilweise stark zur Seite oder nach unten.

Alle verwendeten Filterpapiere wurden für 15 Minuten in einem Dampfdrucktopf sterilisiert und bis zu den Versuchen gut verpackt im Kühlschrank gelagert. Die Kunststoffkästchen waren nicht aus dampfsterilisierbarem Material und wurden lediglich mit Spülmittel gründlich gereinigt und getrocknet.

Um ein gleichmäßiges Keimen zu erreichen, wurden die ausgelegten Samen über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen bis zu etwa 2 Wochen bei +4 °C im Dunkeln vorgequollen. Samen von Arabidopsis C24, die nicht kältevorbehandelt wurden, benötigten zum Keimen bei 23 °C etwa 4 Tage, kältevorbehandelte nur 2 Tage. Die Samen keimten dann gleichmäßiger und stärker synchron. Es war damit auch möglich, mehrere Kästchen mit Samen auf Vorrat bei +4 °C zu lagern und bei Bedarf zum Keimen bei Temperaturen um 20 °C aufzustellen. Eine Lagerung über 2 Wochen hinaus war insbesondere bei Arabidopsis C24 problematisch, da diese Samen dann bereits in der Kälte zu keimen begannen. Gequollene Samen von Cardaminopsis arenosa konnten bis zu 4 Wochen auf Vorrat gehalten werden. Günstig war auch, jede Woche eine kleinere Portion Samen direkt auf schwarzem Filterpapier in einem Kunststoffkästchen auszustreuen und bei 4 °C zum Quellen zu bringen. Die recht zeitaufwendige Montage der Samen auf die ausgestanzten, schwarzen Filterpapierscheibchen erfolgte dann erst 2 Tage vor Versuchsbeginn. Der Versuch, fertig montierte Kästchen mit Samen auf Scheibchen bei -20 °C tiefzufrieren, um diese auf Vorrat zu halten und bei Bedarf einfach aufzutauen, schlug fehl. Nur wenige der so vorbehandelten Samen keimten. Um für jedes Experiment die nötige Anzahl von Keimlingen in der richtigen Größe zur Verfügung zu haben, wurden in der Regel zwei bis drei mal so viele Samen zum Keimen ausgelegt, wie Pflanzen für den geplanten Versuch benötigt wurden.

Anders als bei früheren Arbeiten von Schuster wurden alle Versuche mit (Tübinger) Leitungswasser als Medium durchgeführt. Da die meisten Versuche ohne Verdunstungsschutzhaube durchgeführt wurden, hätte sich bei Verwendung einer Nährsalzlösung die Salzkonzentration auf der Pflanzenunterlage zu sehr erhöht. In Leitungswasser verkeimten und verpilzten Unterlagen und Dochte viel seltener als in Nährlösungen. Die verminderte Saugfähigkeit verkeimten Papiers war wahrscheinlich Ursache dafür, dass die Wasserversorgung der Keimlinge oft zusammenbrach. Besonders bei längeren Versuchen zum Registrieren circadianer Rhythmen war dies äußerst störend. Jedoch zeigten Verdunstungsversuche ohne Keimlinge, bei denen dem Nährmedium Formaldehydlösung beigesetzt wurde und deshalb kein Keim- oder Pilzwachstum hätte auftreten dürfen, ebenfalls gelegentlich Probleme beim Weiterleiten der Flüssigkeit.

Bei Versuchen, in denen die Pflanzen von oben aufgenommen wurden, ergaben sich mitunter störende Lichtreflexe auf dem feuchten Filterpapier der Unterlage. Um diese zu vermeiden, wurde versucht, die Unterlage mit einer matten schwarzen Lochmaske aus Kunststoff abzudecken, die nur einzelne Löcher für die gewünschte Anzahl der Pflanzen enthielt. Die Pflanzen vertrockneten jedoch häufig, vermutlich aufgrund lokal niedriger Luftfeuchte.

Erst gegen Ende der Versuchsserien stand eine Klimakammer zur Verfügung, bei der die Frischluftzufuhr komplett unterbunden werden konnte. Hier wurden mit einem Luftbefeuchter relative Feuchten über 70% erreicht. Dies war für das Keimen und Wachsen der Pflanzen optimal.

Zur Beleuchtung bei der Anzucht und bei der Registrierung mit Atari PCs wurde ein Belichtungskasten mit zwei Leuchtstoffröhren [3] ausgestattet, die mit zwei Lagen Graufolie [4] umwickelt waren. In Pflanzenhöhe ergab sich ein Photonenfluss von 1,75 µmol m-2 s-1 bis 2 µmol m-2 s-1.

Bei der Registrierung mit den Verfahreinheiten wurde nur eine Leuchtstoffröhre verwendet, die mit einer Graufolie umwickelt war. Die Beleuchtungsstärke in Pflanzenhöhe wurde durch den Abstand der Leuchtstoffröhre von der Auflage auf den gewünschten Wert einreguliert. Die Röhre wurde mit Hilfe eines Lots senkrecht über den Keimlingen montiert, damit diese nicht schräg wuchsen. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Registrierung mit den Verfahreinheiten bei einem Photonenfluss von 1,75 µmol m-2 s-1 bis 2 µmol m-2 s-1.